Введение

Согласно Стратегии повышения качества пищевой продукции в Российской Федерации до 2030 г. приоритетным направлением является разработка современных технологий производства пищевых ингредиентов и технологии переработки пищевой продукции, включая биотехнологии для создания условий производства пищевой продукции нового поколения с заданными характеристиками качества, и продвижения принципов здорового питания.
В соответствии с этим исследования в области создания технологий и проектирования рецептурных составов функциональных, обогащенных, специализированных пищевых продуктов, в частности на рыбной основе, с использованием методов биотехнологической обработки, например биотрансформация сырья бактериальными заквасочными культурами (БЗК), являются актуальными и развивающимися [1].

В пищевой биотехнологии на данном периоде развития особое внимание уделяется использованию перспективных штаммов БЗК для получения пищевой продукции с улучшенными качественными характеристиками и функциональной направленностью. Бактериальные заквасочные культуры как защитные микроорганизмы проявляют антиоксидантные, бактерицидные и антагонистические свойства, и за счет образования метаболитов (кислоты, бактериоцины) возможно возникновение эффекта биоконсервирования, что будет способствовать продлению сроков годности пищевой продукции, в частности рыбной. Применение БЗК в технологии производства пищевой рыбной продукции также позволит улучшить ее органолептические свойства (коррекция консистенции и минимизация рыбного вкуса и запаха за счет мягкой деструкции белковых компонентов и снижения уровня образования азотистых летучих оснований в мышечной ткани рыб) и повысить питательную ценность (за счет накопления белковых и эссенциальных веществ) [2, 3]. При этом биохимические процессы, протекающие в рыбном сырье под действием БЗК и приводящие к накоплению белковых и эссенциальных веществ, а также наличие пробиотиков
и постбиотиков способствуют получению обогащенного пищевого продукта, соответствующего принципам здорового образа жизни, с пробиотической направленностью для поддержания функциональной активности органов и тканей человека, корректирования состава внутренней индигенной микрофлоры кишечной микробиоты и, как следствие, повышения иммунной защиты организма [4].

В связи с этим основной целью научных исследований являлась верификация оптимальных условий и технологических параметров биотрансформации рыбного сырья с применением БЗК.

Объекты и методы исследований

В качестве основных объектов для изучения возможности биотрансформации рыбного сырья БЗК были выбраны:

– филе промысловых видов рыб – минтай (Theragra chalcogramma), треска (Gadus macrocephalus), макрурус малоглазый (Albatrossia pectoralis);

– филе потенциально промысловых видов рыб – получешуйника Гилберта (Hemilepidotus gilberti);

– ранее подобранные штаммы БЗК [5]: Lactobacillus casei LC 4P1, Lactobacillus acidophilus А630, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Пб), Streptococcus thermophilus ST 440, Propionibacterium freudenreichii KM-186, Bifidobacterium bifidum 8₃;

– модельные растворы среды для биотрансформации: 3,5 %-й раствор глюкозы, восстановленная молочная сыворотка.

Органолептическую оценку рыбного сырья после биотрансформации БЗК (цвет, запах, консистенция) проводили по разработанной 5-балльной шкале [6]. Массовую долю воды, белка, жира углеводов и золы определяли по ГОСТ 7636-85, ГОСТ 34134-2017 [7, 8]. Активную кислотность (рН) определяли с помощью рН-метра Testo 106. Активность воды (A_w) определяли на приборе Aqualab 4TEV. Титруемую кислотность определяли по ГОСТ 3624-92 [9]. Влагосвязывающую способность (ВСС) определяли весовым методом [8]. Исследование микроструктуры образцов мышечной ткани филе рыб проводили с использованием бинокулярного микроскопа марки «Микмед-5» с оптическим увеличением × 40. Общую микробную обсемененность (КМАФАнМ) и общее количество молочнокислых бактерий в образцах мышечной ткани филе рыб до и после биотрансформации БЗК определяли с использованием петрифильмов 3M Petrifilm (AC) в соответствии с методическими указаниями производителя [10].

Результаты и их обсуждение

На основании ранее проведенного математического моделирования [11] рассчитаны и подобраны оптимальные условия и параметры биотрансформации рыбного сырья с применением БЗК: средами для биотрансформации были выбраны 3,5 %-й раствор глюкозы и восстановленная молочная сыворотка; количество вносимых БЗК – не менее 4,5 · 10 lg КОЕ/г для раствора глюкозы и 5 · 10 lg КОЕ/г для восстановленной молочной сыворотки; рН среды для биотрансформации – не более 5,3–5,9 в начале процесса и не менее 4,3–4,6 в конце процесса; соотношение «сырье : раствор» было принято 1 : 2; продолжительность процесса биотрансформации – не менее 5 ч при температуре 37 °С.

На данном этапе исследований экспериментально подтверждались подобранные с помощью математического моделирования условия, режимы, эффект биоконсервирования, а также производился выбор определенных БЗК и сред для биотрансформации рыбного сырья посредством изучения влияния штаммов микроорганизмов и их метаболитов на свойства и показатели качества мышечной ткани филе изучаемых видов рыб. Контрольным образцом являлась мышечная ткань филе рыб, не подвергнутая воздействию БЗК.

В результате проведенного процесса биотрансформации показатели химического состава обработанных образцов мышечной ткани филе рыб под действием метаболитов БЗК претерпевали некоторые изменения по сравнению с контролем (табл. 1).

Таблица 1

Table 1

Средние значения химического состава до и после биотрансформации образцов мышечной ткани филе рыб
в модельных растворах (раствор глюкозы и восстановленная молочная сыворотка)*

Average values of chemical composition before and after biotransformation of fish fillet muscle tissue samples
in model solutions (glucose solution and reduced whey)

* 1 – контроль; 2 – глюкоза; 3 – восстановленная молочная сыворотка.

Влияния вида БЗК на резкое изменение химического состава не обнаружено, в связи с этим указана средняя динамика в зависимости от вида мышечной ткани филе рыб и модельного раствора для биотрансформации.

Повышение содержания белка в среднем на 1 % (см. табл. 1) в образцах мышечной ткани рыб связано с накоплением бактериальной массы микроорганизмов в процессе своего развития. Особенно активное накопление биомассы наблюдалось с использованием штаммов БЗК L. acidophilus А630, L. casei LC 4P1, B. bifidum 8₃. При этом динамика роста содержания белка положительная как в 3,5 %-м растворе глюкозы, так и в восстановленной молочной сыворотке. Снижение количества жиров, углеводов и минеральных веществ связано с ростом БЗК в растворах, которые используют данные вещества (помимо внесенных углеводов) для своего питания и дальнейшего развития, а также с переходом растворяемых форм веществ в модельные растворы при биотрансформации [12].

Данные по органолептической оценке в виде профилограмм запаха, консистенции и цвета образцов мышечной ткани филе рыб после процесса биотрансформации БЗК представлены на рис. 1.

а 

б

Рис. 1. Профилограммы запаха, консистенции и цвета образцов мышечной ткани филе рыб до и после процесса
биотрансформации БЗК в модельных растворах: а – раствор глюкозы 3,5 %; б – восстановленная молочная сыворотка

Fig. 1. Profilograms of smell, consistency and color of fish fillet muscle tissue samples before and after the process

biotransformation of BPC in model solutions: a – glucose solution of 3.5%; б – reduced whey

Отмечалось, что обработка растворами с БЗК, кроме растворов с L. bulgaricus (Пб), P. freudenreichii KM-186, B. bifidum 8₃, положительно влияет на органолептические показатели филе выбранных видов рыб. В модельном растворе глюкозы (3,5 %) для мышечной ткани филе минтая и трески наиболее оптимальными БЗК оказались L. acidophilus А630, для макруруса и бычка – St. thermophilus ST 440, в восстановленной молочной сыворотке БЗК для мышечной ткани филе минтая – L. casei LC 4P1, трески, макруруса и бычка – L. acidophilus А630. Запах образцов исследования после биотрансформации был оценен как приятный с легкой кислинкой. Рыбный запах после воздействия L. acidophilus А630 и St. thermophilus ST 440, по сравнению с контролем, практически отсутствовал, и был оценен в 4–5 баллов. Исследованные образцы имели кремовый или серый цвет и консистенцию, распадающуюся на волокна по сравнению с более плотной консистенцией контрольных образцов мышечной ткани филе рыб (1–2 балла). В образцах мышечной ткани филе макруруса консистенция была мажущаяся (5 баллов).

Ароматические характеристики образцов с культурами БЗК L. bulgariсus (Пб), P. freudenreichii KM-186 и B. bifidum 8₃ характеризуются как специфичные и негармоничные (1–3 балла). В частности, при обработке пропионовыми (P. freudenreichii KM-186) и бифидобактериями (B. bifidum 8₃), присутствовали неприятные, несвойственные запахи, что связано со способностью данных микроорганизмов продуцировать уксусную и пропионовые кислоты, которые и обуславливают специфическое органолептическое восприятие [13].

Были проведены микроструктурные исследования мышечной ткани филе выбранных видов рыб до и после процесса биотрансформации БЗК (рис. 2).

Рис. 2. Микроструктура мышечной ткани филе рыб до и после биотрансформации БЗК:
а – минтай до обработки; б – минтай после обработки; в – треска до обработки; г – треска после обработки;
д – макрурус до обработки; е – макрурус после обработки; ж – бычок до обработки; з – бычок после обработки.
Ув. × 40

Fig. 2. Microstructure of muscle tissue of fish fillets before and after biotransformation of BZK:

a – pollock before processing; б – pollock after processing; в – cod before processing; г – cod after processing;

д – macrurus before processing; е – macrurus after processing; ж – goby before processing; з – goby after processing.

Enlargement × 40

Следует отметить, что микроструктура мышечной ткани не зависела от вида используемого БЗК и среды при обработке и изменения были аналогичны друг другу, в связи с этим показана общая закономерность микроструктурных изменений.

Проанализировав микроструктуру мышечной ткани филе рыб до и после биотрансформации, можно сделать вывод, что после процесса волокна миофибрилл отделялись друг от друга и распадались на «нити», что, вероятнее всего, связано с воздействием кислот на белковую структуру самих волокон с последующей их деструкцией, приводящей к снижению прочности. Таким образом, обработанное рыбное сырье может являться оптимальной пищевой матрицей для создания гомогенизированных и тонкоизмельченных продуктов, что позволит модернизировать параметры измельчения за счет более мягкой структуры мышечной ткани [14].

В мышечной ткани филе рыб наблюдается незначительное снижение pH после 5 ч выдержки в используемых для процесса биотрансформации модельных растворах с БЗК, при этом под действием L. acidophilus А630 и St. thermophilus ST 440, по сравнению с другими БЗК (L. casei LC 4P1, L. bulgaricus (Пб), P. freudenreichii KM-186, B. bifidum 8₃), протекало более активное подкисление: в среде с глюкозой – для мышечной ткани филе минтая до 6,51, трески – 6,01, макруруса – 6,84, бычка – 5,98; в среде восстановленной молочной сыворотки для мышечной ткани филе минтая до 6,30, трески – 5,98, макруруса – 6,70, бычка – 5,70.
В сыворотке снижение рН в кислую сторону интенсивней по сравнению с раствором глюкозы. С целью ингибирования микроорганизмов кислые значения рН предпочтительнее, чем щелочные, но при этом сильного подкисления в образцах мышечной ткани рыб после процесса биотрансформации не наблюдается [15].

В модельных растворах (3,5 %-й раствор глюкозы и восстановленная молочная сыворотка) для биотрансформации вне зависимости друг от друга наблюдается снижение рН в среднем до 4,4 единицы, что связано с процессом метаболизма и последующим образованием органических кислот, влияющих на кислотности растворов [13]. Как показали исследования, характер изменения активной кислотности идентичен для всех образцов мышечной ткани филе рыб и растворов, поэтому выбранные растворы могут являться взаимозаменяемыми. Также рН сред для биотрансформации в конце процесса коррелировал с данными, полученными при математическом моделировании, статистическая ошибка минимальна.

В процессе биотрансформации происходит уменьшение ВСС в образцах мышечной ткани филе рыб (в среднем – в растворе глюкозы: минтай на 15,32 %, треска – 11,34 %; макрурус – 17,58 %; бычок – 12,79 %; в восстановленной молочной сыворотке: минтай на 15,47 %; треска – 12,35 %; макрурус – 16,89 %; бычок – 13,29 %). Данную закономерность можно объяснить смещением рН в кислую сторону, а также деструктивными изменениями мышечной ткани, вследствие чего для дальнейшего применения обработанного филе в технологиях производства формованных и структурированных продуктов необходимо использовать специальные технологические приемы и структурообразующие агенты [3].

После процесса биотрансформации было определено количество остаточных живых клеток БЗК в обработанных образцах мышечной ткани филе рыб для подтверждения их наличия (табл. 2).

Таблица 2

Table 2

Количество БЗК в образцах мышечной ткани филе рыб после биотрансформации, КОЕ/г

The amount of BSC in muscle tissue samples of fish fillets after biotransformation, CFU/g

Количество клеток БЗК в исследуемых образцах мышечной ткани филе рыб превышает 10⁷–10⁹ КОЕ/г [16–19], что обосновывает возможность применения в рецептурных составах пробиотических пищевых продуктов на рыбной основе.

Для  определения  возможности  использования  полученного сырья для продуктов питания, подвергаемых термической обработке, были проведены исследования по способности БЗК, находящихся в мышечной ткани филе рыб, выдерживать определенные температурные режимы (табл. 3).

Таблица 3

Table 3

Выживаемость БЗК в мышечной ткани рыбы после биотрансформации под действием температуры, КОЕ/г

Survival of BSC in fish muscle tissue after biotransformation under the influence of temperature, CFU/g

Не выявлено влияния вида мышечной ткани филе рыб на выживаемость БЗК, в соответствии с этим показана обобщенная, для всех образцов, тенденция к изменению изучаемого показателя.

Согласно полученным данным по выживаемости БЗК под воздействием различных термических режимов обработки в течение 15, 30, 45 и 60 мин было определено, что L. casei LC 4P1 и St. thermophilus ST 440 способны оставаться жизнеспособными в количестве 30 % при температуре 70 °С в течение 60 мин. Все остальные культуры БЗК выживают при температуре 60 °С в количестве 80 % от изначального значения. Таким образом, оптимальным режимом термической обработки полученного биотрансформированного рыбного сырья является воздействие температуры от 60 до 70 °С в течение 60 мин, что необходимо учитывать при разработке пищевого продукта на его основе и подразумевает использование щадящих режимов термического воздействия, например технология «Су-Вид» [20].

Следует отметить, что количество L. casei LC 4P1 и St. thermophilus ST 440 при температуре 70 °С в течение продолжительности обработки 15, 30, 45, 60 мин составляет меньше 10⁶–10⁹ КОЕ/г, а остальные культуры БЗК погибают, что не соответствует требованиям, предъявляемым к пробиотическим продуктам питания [16, 17], в связи с этим необходимо включать в рецептурный состав продукта простые углеводы и пищевые протекторы, чтобы защитить БЗК и активировать их рост [21], а также созревание (выдержку), продолжительность которого зависит от стационарной фазы роста [13]. В случае гибели клеток бактерий пробиотический эффект будут оказывать постбиотики, определение которым дала Международная научная ассоциация пробиотиков и пребиотиков (ISAPP) в 2021 г. и определила постбиотик как «препарат из неживых микроорганизмов и/или их компонентов, который приносит пользу для здоровья хозяина» [22].

Также в качестве защитного механизма возможно использовать сублимацию, которая активно используется для получения сухих форм БЗК и позволяет сохранить их жизнеспособность за счет анабиоза и последующего их активирования оптимальными условиями, в частности температурой и воздействием внутренней среды желудочно-кишечного тракта человека [1, 3, 13].

В последующих исследованиях определялась устойчивость клеток БЗК к выживанию в течение 7 суток при температуре 0–4 °С в образцах мышечной ткани филе рыб после биотрансформации для обоснования динамики их скорости отмирания (табл. 4).

Таблица 4

Table 4

Динамика изменения численности БЗК при хранении образцов мышечной ткани филе рыб
после биотрансформации, КОЕ/г

Dynamics of changes in the number of BSCs during storage of fish fillet muscle tissue samples
after biotransformation, CFU/g

Анализируя данные табл. 4, можно предположить, что количество клеток БЗК в среднем уменьшается на 10²–10³ КОЕ/г, что связано с началом их фазы отмирания и температурой хранения. Исходя из этого можно аппроксимировать количественное содержание бактерий на 14 и 28 сутки хранения, что будет равняться 10⁴ и 10¹ КОЕ/г соответственно. Наиболее устойчивыми культурами БЗК в процессе хранения обработанных образцов являются L. acidophilus А630 и St. thermophilus ST 440. Полученные данные по выживаемости БЗК в процессе хранения мышечной ткани филе рыб также подтверждают необходимость дополнительного внесения углеводов и протекторных пищевых веществ
в рецептурный состав продуктов для поддержания их количества на уровне 10⁶–10⁷ КОЕ/г в течение всего срока годности [16, 17].

При исследовании микробиологической безопасности было отмечено, что по прошествии 7 суток хранения при 0–4 °С в контрольных образцах необработанной мышечной ткани филе рыб наблюдалось превышение показателя КМАФАнМ [3, 12] по сравнению с обработанными образцами мышечной ткани (табл. 5).

Таблица 5

Table 5

Динамика изменения КМАФАнМ после биотрансформации и в процессе хранения, КОЕ/г

Dynamics of changes in CMAFAnM after biotransformation and during storage, CFU/g