KINETIC ANALYSIS OF THE ENZYMATIC HYDROLYSIS OF FISH MUSCLE TISSUE PROTEIN
Abstract and keywords
Abstract (English):
The aim of the study is to evaluate the feasibility of the use of experimental methods of kinetic analysis of protein enzymatic hydrolysis of the complex multi-component enzyme-substrate system for the process orientation determining. The results of the experimental-theoretical studies of the kinetic process for the enzyme-substrate systems containing enzyme Protosubtilin G3X of 0.01 and 0.05 mg/g are given. The analysis of the experimental kinetic curves suggests that for both enzyme concentrations in the considered time interval hydrolysis has the character of the fading process of the retention of nitrogen of watersoluble thermally stable compounds in the hydrolyzate. The damping cause can be due to specific substrate exhausting or competitive displacement of macromolecular proteins – substrate by reaction products. To determine the cause of the decay the experimental curves, presented in the integrated Michaelis – Menten equation, were converted into Walker – Schmidt coordinates. From the transformed integral form, the values of enzymatic hydrolysis effective constants were calculated. For the enzyme-substrate systems with a low enzyme content the effective constants are negative that indicates the competition for the active sites of the enzyme between the macromolecular protein substrates and the products of their hydrolysis. For the enzyme-substrate systems with a high enzyme content such regularities are not revealed. The possibility of kinetic analysis method application for the preliminary assessment of the character and depth of the protein enzymatic hydrolysis is stated. The revealed regularities give grounds to assert that for obtaining the hydrolyzate of the forecasting content the process should be carried out at a lower dose of the enzyme. Nitrogenous substances of the hydrolyzate will be generally presented with heavy peptides.

Keywords:
hydrolyzate, kinetic analysis, enzymatic hydrolysis, Michaelis constant, competitive inhibition, protosubtilin
Text
Publication text (PDF): Read Download

Введение Современные направления развития рыбообрабатывающей промышленности предусматривают разработку комплексных, малоотходных технологий переработки гидробионтов. Одним из наиболее перспективных методов реализации такого подхода является применение ферментативных технологий для получения продуктов различного состава и назначения. Широко распространенные варианты ферментированных рыбных продуктов – это рыбные гидролизаты, которые применяются для корректировки аминокислотных формул многих видов пищевых продуктов, используются в качестве компонентов рыбных соусов, спортивного питания, вкусоароматических добавок, биоактивных препаратов, кормов, удобрений и др. [1, 2]. Общей проблемой применения пищевых и кормовых ферментативных гидролизатов является горький привкус продукта вследствие образования гидрофобных пептидов из 4–10 аминокислотных остатков, в то время как наличие в гидролизате более крупных и, наоборот, более мелких пептидов позволяет избежать неприятного привкуса и увеличивает биологическую ценность продукта [3, 4]. Состав образующихся при гидролизе фрагментов белковых молекул зависит не только от вида исходного сырья и примененного ферментного препарата, но и условий ферментолиза, при этом теоретически обоснованного подхода к оценке этих условий до настоящего времени не выработано. В технологии ферментативных белковых гидролизатов, при формировании фермент-субстратных систем, всегда образуется сложная смесь, состоящая из раствора ферментного препарата, растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов тканей сырья различной природы. При этом в промышленных фермент-субстратных системах, часто вместе с ферментолизом, протекают автолитические процессы. Очевидно, что при ферментативном гидролизе подобных поликомпонентных субстратных систем образуются многочисленные продукты, и некоторые из них способны к конкурентному ингибированию индивидуальных протеаз ферментного препарата [5]. В этом случае образовавшиеся продукты реакции – ингибиторы – будут конкурировать с исходным белковым субстратом за активный центр фермента. Кинетическая схема такого ферментативного процесса будет иметь следующий вид [6]: Если сродство каких-либо из образовавшихся в результате гидролиза продуктов реакции к имеющимся в системе индивидуальным ферментам выше, чем у белков исходного субстрата, то процесс может приобрести циклическую форму. В этом случае протекающая на первом этапе ферментативная деградация высокомолекулярных белков будет тормозиться, а скорость гидролиза конкурентных продуктов реакции будет возрастать до их исчерпания, затем вновь активизируется гидролиз белков исходного субстрата и т. д. Из приведенного предположения следует, что если сродство белков исходного субстрата к большинству индивидуальных ферментов выше, чем у образовавшихся продуктов, то азотистые вещества такого гидролизата на длительном временном отрезке ферментолиза будут представлены в основном крупными белковыми фрагментами. Для описания кинетики ферментативных процессов для сложных фермент-субстратных систем принято применять интегральную форму уравнения Михаэлиса – Ментен, которая имеет следующий вид [7, 8]: , (1) где ∑[P] – суммарное количество продуктов реакции; τ – продолжительность процесса; K'm – кажущаяся константа Михаэлиса; V'm – кажущаяся максимальная скорость процесса; ∑[S]0 – начальное суммарное количество белков-субстратов. Кажущаяся константа Михаэлиса и кажущаяся максимальная скорость процесса аналогичны классическим показателям ферментативной кинетики, но учитывают совокупность ферментативных процессов при сложном многокомпонентном составе субстрата в растворенном и взвешенном состоянии. Чем меньше значение K'm, тем выше алгебраически суммарное сродство основного субстрата к имеющимся в системе ферментам. Для дальнейшего анализа интегральную форму уравнения Михаэлиса – Ментен (1) следует привести к линейному виду. Наиболее часто для этого применяются координаты Вокера – Шмидта [7, 9, 10], в которых уравнение (1) приобретает вид (2) Полученная в результате преобразования прямая имеет тангенс угла наклона равный K'm и отсекает на оси ординат отрезок равный V'm. Интерпретация [7] уравнения (2) с учетом возможного конкурентного ингибирования ферментов продуктами реакции приводит к выражению Введенная в уравнение константа ингибирования Ki характеризует процесс конкурентного ингибирования фермента продуктами реакции. В этом случае возникает новая комплексная кинетическая константа: . (3) Эту величину принято называть эффективной константой ферментативного процесса. Она аналогична по физическому смыслу видимой константе Михаэлиса, но учитывает не только особенности процесса в многокомпонентной фермент-субстратной системе, но и возможный процесс обратимого конкурентного ингибирования. В этом случае свободный член уравнения Михаэлиса – Ментен в координатах Вокера – Шмидта приобретает смысл максимальной эффективной скорости процесса. . Если предположить, что K'm > Ki; т. е ситуацию, когда конкурентный ингибирующий продукт реакции имеет значительно большее сродство к ферменту по сравнению с исходным субстратом, то значения эффективной константы ферментативного процесса, определенные из уравнений (3), будут иметь отрицательные значения. Эта ситуация имеет физический смысл практически полного конкурентного замещения в катализе исходного субстрата продуктами реакции. Сделанные теоретические предположения представляются реальным при продолжительном процессе ферментативного гидролиза, а приведенный подход после экспериментального подтверждения может быть использован для прогнозирования протекания процесса ферментолиза и состава получаемого гидролизата. Таким образом, цель исследований состояла в экспериментальной оценке возможности использования интегральной формы уравнения Михаэлиса – Ментен с линеаризацией Вокера – Шмидта для анализа направленности процесса ферментативного гидролиза белков сложной многокомпонентной фермент-субстратной системы. Для достижения поставленной цели в работе рассматривались следующие задачи: - сформировать модельные фермент-субстратные системы с различным значением концентрации белковых веществ ∑[S]0; - получить экспериментальные кинетические кривые ферментативного гидролиза белков принятых модельных систем; - на основе полученных экспериментальных данных рассчитать и оценить значения эффективной константы ферментативного процесса Kэфф, описывающие процесс ферментолиза белков рассматриваемых фермент-субстратных систем. Материалы и методы исследования В исследованиях в качестве фермент-субстратных систем были использованы водные диспергаты измельченного филе азовского бычка (Gobius melanostomus) с диапазоном концентрации белков 40–60 мг/г с добавлением ферментного препарата микробиологического происхождения протосубтилин Г3Х при его концентрации в системе 0,01 и 0,05 мг/г. Гидролиз проводили в течение 225 минут при температуре 50 ºС, постоянном перемешивании и естественных значениях рН на фоне характерного для данного вида сырья автолитического процесса. Протекание процесса ферментолиза оценивали по накоплению азота соединений, остающихся в гидролизате после его кипячения и фильтрования (термоустойчивые водорастворимые азотистые вещества (ВА)) и азота соединений после осаждения белков трихлоруксусной кислотой и фильтрования (небелковые азотистые вещества (НБА)). Количество ВА и НБА определяли по методу Къельдаля (анализатор VELP Scientifica). Результаты исследований и их обсуждение Полученные экспериментальные зависимости накопления азота термоустойчивых водорастворимых соединений в зависимости от продолжительности ферментолиза при концентрации ферментного препарата 0,01 мг/г (рис. 1) на начальном этапе процесса (примерно в течение первых 50–60 минут ферментолиза) имеют линейный характер. Они аналогичны друг другу и характеризуются на этом этапе практически одинаковой скоростью процесса. Дальнейшее продолжение гидролиза приводит к возникновению значительных различий в характере кривых. Зависимости, полученные для высоких концентраций субстрата (60–50,25 мг/г) имеют монотонный характер без точек перегиба. Экспериментальная кривая, полученная для субстрата с концентрацией белковых веществ 40,5 мг/г, имеет статистически достоверную точку перегиба при продолжительности процесса на уровне 200–210 минут. Более выраженная точка перегиба характерна для кривой, полученной в результате гидролиза субстрата с концентрацией белков 30,75 мг/г. Она наблюдается при продолжительности процесса около 125 минут, разделяя экспериментальную кривую на 2 похожих по своему характеру участка. Рис. 1. Динамика накопления азота водорастворимых веществ в процессе гидролиза белков мышечной ткани рыбы ферментным препаратом протосубтилин ГЗХ с концентрацией 0,01 мг/г. Концентрация субстрата, мг/г: 30,75; 40,50; 50,25; 60,00 Для корректной интерпретации происходящих процессов аппроксимирующие экспериментальные кинетические зависимости (табл. 1) были подвергнуты дифференциальному анализу. Полученные значения второй производной уравнений, аппроксимирующих экспериментальные кинетические зависимости, позволяют утверждать, что в рассматриваемом временном интервале ферментолиз имеет характер затухающего процесса по принятому индикаторному показателю ВА. Теоретически причиной затухания прироста накопления ВА может быть как исчерпание специфичного субстрата, так и конкурентное замещение высокомолекулярных белков продуктами реакции. Для выяснения причины затухающего поведения процесса необходимо линеаризовать экспериментальные зависимости в координатах Вокера – Шмидта на криволинейных участках экспериментальных зависимостей (рис. 1). Результаты линеаризации, с последующей линейной аппроксимацией, представлены в табл. 2. Таблица 1 Результаты исследования уравнений, аппроксимирующих экспериментальные зависимости накопления азота водорастворимых веществ в процессе гидролиза мышечной ткани рыбы ферментным препаратом протосубтилин Г3Х с концентрацией 0,01 мг/г Начальная концентрация белковых веществ в субстрате, мг/г Полином, аппроксимирующий экспериментальные кинетические кривые Первая производная Вторая производная 60,00 –0,0001τ2 + 0,08τ –0,0002τ + 0,08 –0,0002 54,27 –0,0002τ2 + 0,0831τ –0,0004τ + 0,0831 –0,0004 43,74 –0,0002τ2 + 0,0788τ –0,0004τ + 0,0788 –0,0004 30,75 1-й участок (0–125 мин) –0,0004τ2 + 0,087τ –0,0008τ + 0,087 –0,0008 2-й участок (125–225 мин) –4·10-5τ2 + 0,087τ –8·10-5τ + 0,0885 –8·10-5 Таблица 2 Уравнения, аппроксимирующие линеаризованные в координатах Вокера – Шмидта экспериментальные кривые накопления азота водорастворимых веществ в процессе гидролиза мышечной ткани рыбы ферментным препаратом протосубтилин Г3Х с концентрацией 0,01 мг/г Концентрация белковых веществ в субстрате, мг/г Аппроксимирующее уравнение функциональной зависимости 60,00 –3,1388 0,3547 54,27 –1,6753 0,2886 43,74 –3,1862 0,3622 30,75 1-й участок (0–125 мин) –1,5306 0,2486 2-й участок (125 – 225 мин) –40,614 1,748 Полученные отрицательные расчетно-экспериментальные значения эффективной константы ферментативного процесса позволяют определить ферментолиз субстрата на основе белков филе азовского бычка по индикаторному показателю ВА как затухающий процесс, протекающий в условиях активного конкурентного ингибирования индивидуальных ферментов препарата протосубтилин Г3Х продуктами реакции. Сделанный вывод подтверждается экспериментальными данными динамики накопления НБА (рис. 2). Рис. 2. Динамика накопления небелкового азота в процессе гидролиза белков мышечной ткани рыбы ферментным препаратом протосубтилин ГЗХ с концентрацией 0,01 мг/г. Концентрация субстрата, мг/г: 30,75; 40,50; 50,25; 60,00 Из рис. 2 видно, что на первом этапе ферментативного гидролиза количество НБА возрастает незначительно. В гидролизате интенсивно накапливаются термоустойчивые ВА. Интенсификация накопления НБА совпадает с периодом практически полной остановки накопления ВА в гидролизате на втором этапе процесса, т. е. гидролиз высокомолекулярных белков практически полностью конкурентно заменяется на ферментативную деградацию их крупных фрагментов. Экспериментальные зависимости, полученные при исследовании процесса накопления термоустойчивых ВА в фермент-субстратных системах с концентрацией ферментного препарата 0,05 мг/г, представлены на рис. 3. В данном случае процесс ферментолиза даже на начальных этапах протекает с различной скоростью, но в целом также имеет затухающий характер (табл. 3). Рис. 3. Динамика накопления азота водорастворимых веществ в процессе гидролиза белков мышечной ткани рыбы ферментным препаратом протосубтилин ГЗХ с концентрацией 0,05 мг/г. Концентрация субстрата, мг/г: 30,75; 40,50; 50,25; 60,00. Таблица 3 Результаты исследования уравнений, аппроксимирующих экспериментальные зависимости накопления азота водорастворимых веществ в процессе гидролиза мышечной ткани рыбы ферментным препаратом протосубтилин Г3Х с концентрацией 0,05 мг/г Начальная концентрация белковых веществ в субстрате, мг/г Полином, аппроксимирующий экспериментальные кинетические кривые Первая производная Вторая производная 60,00 –0,001τ2 + 0,2643τ –0,002τ + 0,2643 –0,002 54,27 –0,0005τ2 + 0,1871τ –0,001τ + 0,1871 –0,001 43,74 –0,0004τ2 + 0,149τ –0,0008τ + 0,149 –0,0008 30,75 –0,0002τ2 + 0,0809τ –0,0004τ + 0,0809 –0,0004 Линеаризация экспериментальных зависимостей накопления ВА, полученных в результате применения ферментного препарата с концентрацией 0,05 мг/г в координатах Вокера – Шмидта на криволинейных участках экспериментальных зависимостей (рис. 3), с последующей линейной аппроксимацией, представлена в табл. 4. Таблица 4 Уравнения, аппроксимирующие линеаризованные в координатах Вокера – Шмидта экспериментальные кривые накопления азота водорастворимых веществ в процессе гидролиза мышечной ткани рыбы ферментным препаратом протосубтилин Г3Х с концентрацией 0,05 мг/г Концентрация белковых веществ в субстрате, мг/г Аппроксимирующее уравнение функциональной зависимости 60,00 0,0146 0,0008 54,27 0,018 0,0007 43,74 0,0243 0,005 30,75 0,0318 0,0003 Полученные положительные значения эффективной константы ферментативного гидролиза позволяют утверждать, что процесс в рассмотренном временном интервале не сопровождается ингибированием индивидуальных ферментов промежуточными продуктами гидролиза по конкурентному механизму. Вероятно, выявленный в данном случае характер протекания процесса связан с некоторым «избытком» ферментного препарата. Это предположение может быть подтверждено характером кривых накопления НБА в гидролизате (рис. 4). Монотонный характер зависимостей накопления НБА в гидролизате позволяет утверждать, что присутствие в системе повышенного количества ферментного препарата дает возможность избежать цикличности гидролиза, т. е. фермента достаточно много для одновременного катализа гидролиза как высокомолекулярных исходных белков-субстратов, так и промежуточных пептидов. Рис. 4. Динамика накопления азота водорастворимых веществ в процессе гидролиза белков мышечной ткани рыбы ферментным препаратом протосубтилин ГЗХ с концентрацией 0,05 мг/г. Концентрация субстрата, мг/г: 30,75; 40,50; 50,25; 60,00 Заключение 1. В результате экспериментально-теоретических исследований установлена возможность применения метода кинетического анализа для предварительной оценки характера и глубины ферментативного гидролиза белков. 2. Установлено, что при малых количествах введенного в фермент-субстратную систему ферментного препарата наблюдается конкуренция различных видов субстрата за фермент. Этот процесс приводит к поэтапному накоплению продуктов различной молекулярной массы в гидролизате. 3. Полученные результаты дают основание утверждать, что при малых количествах введенного в фермент-субстратную систему ферментного препарата азотистые вещества гидролизата из мышечной ткани азовского бычка на первом этапе процесса будут представлены в основном высокомолекулярными пептидами. Дальнейшее продолжение ферментолиза будет сопровождаться снижением их количества и накоплением низкомолекулярного НБА. 4. Выявленные закономерности дают основание утверждать, что для получения гидролизата прогнозируемого состава процесс необходимо проводить при пониженной дозе ферментного препарата. 5. С целью повышения достоверности прогноза глубины ферментативного гидролиза необходимы дополнительные исследования по определению значения константы конкурентного ингибирования ферментов продуктами реакции при различных дозах введенного в систему ферментного препарата.
References

1. Almas K. A. Utilization of marinebiomass for production of microbial growth media and biocheemicals / K. A. Almas // Advances in Fisheries Technology and Biotechnology for Increased Profitability – Lancaster Technomic Publication, Comp., 1990.

2. Strom T. Marine biotechnology in Norway / T. Strom, J. Raa // J. Mar. Biotechnology. 1993. 1. P. 3–7.

3. Seafood flavourants produced by enzymatic hydrolysis // Advances in Fisheries Technology and Biotechnology for Increased Profitability – Lancaster Technomic Publication, Comp., 1990.

4. Saisthip Traditional fermented fish: fish sause production // Fisheries Processing: Biotechnological Applications – London, Chapman & Hall, 1994.

5. Rumyanceva G. N. Nauchnye i prakticheskie aspekty ispol'zovaniya fermentativnogo kataliza v pischevoy promyshlennosti / G. N. Rumyanceva, N. I. Dunchenko: monogr. M.: MGUPB, 2007. 101 s.

6. Markovic I. Use of the Foster-Niemann Equation in study of the Enzymic Processes / I. Markovic, V. Topolovec, B. Markovic-Devcic, V. Maric // Food Technology and Biotechnology. 2001. 39.

7. Kornish-Boduen E. Osnovy fermentativnoy kinetiki / E. Kornish-Boduen. M.: Mir, 1979. 272 s.

8. Bayramov V. M. Osnovy himicheskoy kinetiki i kataliza / V. M. Bayramov. M.: Akademiya, 2003. 256 s.

9. Malenica M. Diploma work, Faculty of Food Technology and Biotechnology, University of Zagreb, Zagreb, 1997.

10. Walker J. M. Enzyme Engineering // Molecular Biology and Biotechnology. The Royal Society of Chemistry, Cambrige, 1993.