PHYSIOLOGICAL BIOCHEMICAL AND TEMPERATURE PARAMETERS IN AMUR SLEEPER JUVENILE UNDER CHRONIC ACTION OF ROUNDUP
Authors:
1.
I. D. Papanin Institute of Biology of Inland Waters, Russian Academy of Sciences
2.
I. D. Papanin Institute of Biology of Inland Waters, Russian Academy of Sciences
3.
I. D. Papanin Institute of Biology of Inland Waters, Russian Academy of Sciences (Village Borok, the Yaroslavl Region)
4.
I. D. Papanin Institute of Biology of Inland Waters, Russian Academy of Sciences
Type:
Article
Pages:
from 98
to 103
Status:
Published
Received:
05.09.2013
Accepted:
25.09.2013
Published:
25.09.2013
Subject area:
UDK 597-11:632.954
GRNTI 34.39 Физиология человека и животных
GRNTI 62.13 Биотехнологические процессы и аппараты
GRNTI 69.01 Общие вопросы рыбного хозяйства
GRNTI 69.25 Аквакультура. Рыбоводство
GRNTI 69.31 Промышленное рыболовство
GRNTI 69.51 Технология переработки сырья водного происхождения
GRNTI 87.19 Загрязнение и охрана вод суши, морей и океанов
BBK 28.903
GRNTI 34.39 Физиология человека и животных
GRNTI 62.13 Биотехнологические процессы и аппараты
GRNTI 69.01 Общие вопросы рыбного хозяйства
GRNTI 69.25 Аквакультура. Рыбоводство
GRNTI 69.31 Промышленное рыболовство
GRNTI 69.51 Технология переработки сырья водного происхождения
GRNTI 87.19 Загрязнение и охрана вод суши, морей и океанов
BBK 28.903
Language:
Russian
Keywords:
Amur sleeper, digestive glycosidase, amylolytic activity, maltase, final preferred temperature, critical thermal maximum, Roundup herbicide
Abstract (English):
30-days effect of Roundup herbicide in concentration 2 mg/L on the physiological-biochemical and temperature parameters in Amur sleeper Perccottus glenii juvenile is studied. The negative impact of herbicide on the fish intestinal amylolytic activity, especially under increasing water temperatures is shown. Maltase activity does not change, but the increase in the Km maltose hydrolyze reflects a decrease in the enzyme-substrate affinity under chronic action of herbicide. Temperature resistance of fish (by value of the critical thermal maximum) does not change. However, higher final preferred temperatures testify the impact of Roundup on the thermoregulatory behavior of fish.
30-days effect of Roundup herbicide in concentration 2 mg/L on the physiological-biochemical and temperature parameters in Amur sleeper Perccottus glenii juvenile is studied. The negative impact of herbicide on the fish intestinal amylolytic activity, especially under increasing water temperatures is shown. Maltase activity does not change, but the increase in the Km maltose hydrolyze reflects a decrease in the enzyme-substrate affinity under chronic action of herbicide. Temperature resistance of fish (by value of the critical thermal maximum) does not change. However, higher final preferred temperatures testify the impact of Roundup on the thermoregulatory behavior of fish.
Keywords:
Amur sleeper, digestive glycosidase, amylolytic activity, maltase, final preferred temperature, critical thermal maximum, Roundup herbicide
Amur sleeper, digestive glycosidase, amylolytic activity, maltase, final preferred temperature, critical thermal maximum, Roundup herbicide
Введение Головешка-ротан Perccottus glenii для бассейна Верхней Волги является видом-вселенцем. Его нативный ареал расположен на Дальнем Востоке, в Китае и Северной Корее, в настоящее время он широко распространен в водоемах Северной Евразии [1]. Проявляя высокую адаптивность к действию природных и антропогенных факторов [2–4], ротан угнетающе действует на многие популяции аборигенных видов рыб. По температурным характеристикам (окончательно избираемой и верхней летальной температуре) ротан относится к наиболее теплолюбивым видам рыб, обитающих в пресных водоемах России [4]. Изучение активности пищеварительных ферментов выявило бóльшую устойчивость гликозидаз ротана к действию in vitro низкой температуры, кислых рН и ионов тяжелых металлов (медь, цинк), а также к действию высокой скорости нагрева воды по сравнению с рыбами сем. Cyprinidae [5]. В последние годы появились данные о негативном влиянии гербицида Раундап, широко применяемого для уничтожения сорной растительности в коллекторно-дренажных каналах, оросительных системах и прудах, на активность пищеварительных гликозидаз кишечника [6] и ацетилхолинэстеразы (АХЭ) мозга и мышц рыб [7]. Снижение активности АХЭ, играющей важную роль в синаптической передаче нервного импульса, приводит к нарушению поведения и ориентации рыб в пространстве [7] и, вероятно, может изменять терморегуляционное поведение рыб. Отметим, что действие загрязнителей органической природы на физиолого-биохимические показатели ротана и его температурные характеристики ранее не исследовалось. Цель работы состояла в изучении хронического действия гербицида Раундап на активность гликозидаз в кишечнике молоди ротана, а также его температурные характеристики. Материалы и методы исследования В ходе работы, выполненной в осенний период 2012 г., исследовались сеголетки ротана, отловленные в одном из прудов Некоузского района Ярославской области. В течение 1 месяца перед экспериментом рыб содержали в аквариумах вместимостью 200 л с постоянной аэрацией, 12-часовым периодом освещения, при температуре воды 15,5 ± 1 °С. Масса сеголетков составила 3,12 ± 0,17 г, длина тела – 5,44 ± 0,10 см. Затем рыб разделили на 2 группы: 50 экз. поместили в аквариум с чистой водой, 50 экз. – в аквариум с водой, содержащей Раундап в концентрации 2 мкг/л (2 ПДК). Смену воды в аквариумах производили 2 раза в неделю без отсадки рыб. По истечении 30 суток по 12 экз. из контрольной и опытной групп были взяты для определения активности пищеварительных гликозидаз, по 12 экз. были помещены в термоградиент (с диапазоном значений температуры от 14 до 31 ºС) для определения окончательно избираемой температуры (ОИТ), по 12 экз. были посажены в аквариумы, температуру воды в которых повышали со скоростью 8 ºС/ч до потери рыбами равновесия (переворот на бок), сублетальное значение температуры фиксировали как критический термический максимум (КТМ). В качестве критерия ОИТ была выбрана среднесуточная избираемая температура, значение которой в течение 3-х суток варьирует незначительно (р > 0,05). Более подробно методика определения температурных характеристик описана в [4]. В период акклимации, во время эксперимента с Раундапом и в условиях термоградиента рыб кормили 1 раз в сутки личинками хирономид из расчёта 4 % от общей массы тела. Активность гликозидаз (мальтаза и амилолитическая активность) определяли в гомогенатах медиального отдела кишечника. Амилолитическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал (a-амилаза КФ 3.2.1.1, глюкоамилаза КФ 3.2.1.3 и мальтаза КФ 3.2.1.20) оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [8]. Для определения активности мальтазы применяли набор для клинической биохимии «Фотоглюкоза» (ООО «Импакт», Россия). Ферментативную активность выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 минуту инкубации ферментативно-активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани, мкмоль/(г × мин). Кинетические характеристики гидролиза мальтозы - значения кажущейся константы Михаэлиса Km и максимальной скорости реакции V – определяли графическим методом Лайнуивера – Берка. Для приготовления раствора токсиканта (2 мкг/л) использовали коммерческий препарат гербицида, имеющий торговое название «Раундап» (произведен и расфасован ЗАО «Август» (Россия) по лицензии фирмы «Монсанто Европа С. А.» (Бельгия)). При определении чувствительности гликозидаз к действию Раундапа in vitro гомогенаты предварительно инкубировали в присутствии токсиканта в течение 60 минут. Концентрации Раундапа, рассчитанные по содержанию глифосата, составляли 0,1; 1; 10; 25 и 50 мкг/л. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M ± m). Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Через 30 суток действия Раундапа в концентрации 2 мкг/л масса и длина тела рыб контрольной и опытной групп достоверно не различались (табл. 1). Хроническое действие гербицида снижает амилолитическую активность в кишечнике ротана на 27 % по сравнению с рыбами контрольной группы. Активность мальтазы и максимальная скорость реакции гидролиза мальтозы у рыб опытной группы достоверно не изменяются. В то же время значения Km гидролиза мальтозы возрастают на 37 %, отражая снижение фермент-субстратного сродства при хроническом действии низких концентраций Раундапа. После 30-ти суток действия гербицида чувствительность гликозидаз к действию Раундапа in vitro снижается (табл. 2). Так, торможение амилолитической активности в кишечнике у рыб контрольной группы в присутствии Раундапа в концентрации 0,1–50 мкг/л составило 47–64 %, а у рыб опытной группы – лишь 13–21 % от контроля. Зависимости величины эффекта от концентрации гербицида не выявлено. Таблица 1 Физиолого-биохимические характеристики ротана контрольной и опытной групп после 30 суток воздействия Раундапом в концентрации 2 мкг/л Показатель Контроль Опыт Масса рыб, г 4,86 ± 0,48 5,07 ± 0,39 Длина тела, см 6,10 ± 0,15 6,17 ± 0,13 Амилолитическая активность, мкмоль/(г × мин) 5,56 ± 0,07 4,06 ± 0,06* Активность мальтазы, мкмоль/(г × мин) 6,21 ± 0,15 5,95 ± 0,08 V гидролиза мальтозы, мкмоль/(г×мин) 8,03 ± 0,12 8,01 ± 0,10 Km гидролиза мальтозы, ммоль/л 8,99 ± 0,24 12,3 ± 0,31* Амилолитическая активность после ОИТ и КТМ, мкмоль/(г × мин) 2,70 ± 0,08 1,73 ± 0,24* Активность мальтазы после ОИТ и КТМ, мкмоль/(г × мин) 5,01 ± 0,15 5,56 ± 0,06* Активность мальтазы после КТМ, мкмоль/(г × мин) 5,11 ± 0,21 6,92 ± 0,22* * Различия показателей у рыб опытной и контрольной групп статистически достоверны, р < 0,05. Таблица 2 Чувствительность гликозидаз к действию Раундапа in vitro* Группа Концентрация Раундапа, мкг/л 0 0,1 1 10 25 50 Контроль 4,69 ± 0,10а 1,97 ± 0,08в 1,71 ± 0,11в 1,73 ± 0,17в 1,92 ± 0,11в 2,51 ± 0,17б Опыт 2,82 ± 0,11а 2,45 ± 0,04б 2,44 ± 0,02б,в 2,22 ± 0,10в 2,38 ± 0,07б,в 2,39 ± 0,08б,в * Разные надстрочные индексы указывают на статистически достоверные различия между показателями в каждой строке (ANOVA, LSD-тест), p < 0,05. По истечении 30 суток опыта по 12 рыб из обеих групп отсадили в отсек термоградиента с температурой 15 ºС и предоставили им возможность свободного температурного выбора. По-видимому, в первые несколько суток, когда устойчивых различий в выборе температуры не наблюдается, происходит адаптация организма к новым условиям в градиенте (рис.). В то же время с 5-х по 9-е сутки значения ОИТ у рыб опытной группы были стабильно выше (24,4 ± 0,1 °С) по сравнению с рыбами контрольной группы (22,3 ± 0,1 °С), р < 0,0002. Эти данные свидетельствует о кратковременном влиянии гербицида на терморегуляционное поведение рыб, а выбор более высокой температуры может быть обусловлен необходимостью ускорения процессов метаболизма для вывода токсиканта из организма. Затем различия в уровне избираемой температуры сглаживаются, и на 12-е сутки они составили 24,0 ± 0,5 и 23,9 ± 0,3 ºС у рыб контрольной и опытной групп соответственно. Избираемая температура у молоди ротана контрольной и опытной групп после 30-и суток действия Раундапа в концентрации 2 мкг/л Термоустойчивость ротана после 30-и суток действия Раундапа не меняется, о чем свидетельствует равенство значений КТМ у рыб контрольной (31,3 ± 0,1 ºС) и опытной (31,0 ± 0,2 ºС) групп. После 12-суточного пребывания рыб в термоградиенте значения КТМ были достоверно выше: 35,9 ± 0,42 и 36,4 ± 0,37 ºС, что хорошо согласуется с данными о повышении значений КТМ с ростом температуры акклимации [9], но они также не различались у рыб контрольной и опытной групп. У рыб опытной группы, находившихся в термоградиенте и затем подверженных нагреву, амилолитическая активность на 36 % меньше по сравнению с амилолитической активностью рыб контрольной группы (см. табл. 1). Активность мальтазы у рыб опытной группы, наоборот, выше на 11 %. Кроме того, у ротана опытной группы при нагреве без нахождения в термоградиенте она также выше на 35 %. Ранее, при исследовании взрослых особей ротана, было показано, что повышение температуры воды в зимний период со скоростью 10 °С/ч снижает амилолитическую активность в 1,5 раза, негативно влияя на скорость гидролиза углеводов [10]. У рыб контрольной группы, находившихся в термоградиенте и затем подверженных нагреву, амилолитическая активность снижается на 51 %, активность мальтазы – на 20 %, у рыб опытной группы – на 57 и 7 % соответственно по сравнению с ферментативной активностью, измеренной сразу после 30-и суток действия Раундапа. Наибольшее снижение амилолитической активности – на 69 % от контроля – показано у рыб после хронического действия Раундапа, последующего нахождения в термоградиенте и последующего нагрева. Активность мальтазы снижается лишь на 10 %. Эти данные свидетельствует о негативном влиянии хронического действия Раундапа на суммарную активность ферментов, расщепляющих полисахарид крахмал, которое усиливается с повышением температуры воды, а также о разном влиянии скорости нагрева воды на активность панкреатических (a-амилаза, входящая в состав ферментов, гидролизующих крахмал) и собственно мембранных (мальтаза) ферментов. Заключение Полученные результаты свидетельствуют о негативном влиянии хронического действия гербицида Раундап (2 мкг/л) на амилолитическую активность в кишечнике молоди ротана. Активность мальтазы не меняется, однако увеличение Km гидролиза мальтозы отражает снижение фермент-субстратного сродства при хроническом действии гербицида. Хроническое действие Раундапа снижает чувствительность гликозидаз к in vitro действию гербицида. Термоустойчивость рыб (по КТМ) при 30-суточном действии гербицида не меняется. Однако значения ОИТ на 2 ºС выше по сравнению с контролем, что свидетельствует о влиянии Раундапа на терморегуляционное поведение рыб. Повышение температуры воды со скоростью 8 ºС/ч усиливает негативный эффект хронического действия Раундапа на амилолитическую активность.
1. Reshetnikov A. N. Sovremennyy areal rotana Perccottus glenii Dybowski, 1877 (Odontobutidae, Pisces) v Evrazii / A. N. Reshetnikov // Rossiyskiy zhurnal biologicheskih invaziy. 2009. № 3. S. 22-35.
2. Golovanova I. L. Vliyanie temperatury na aktivnost' pischevaritel'nyh karbogidraz rotana Perccottus glenii Dyb. v zimniy period / I. L. Golovanova, A. K. Smirnov, I. V. Shlyapkin // Biol. vnutr. vod. 2009. № 2. S. 90-92.
3. Karanova M. V. Sostav svobodnyh aminokislot krovi i myshc rotana Perccottus glehni v period podgotovki i zaversheniya gibernacii / M. V. Karanova // Zhurnal evolyuc. biohimii i fiziol. 2009. T. 45, № 1. S. 59-67.
4. Golovanov V. K. Termoizbiranie i termoustoychivost' molodi goloveshki-rotana Perccottus glenii v osenniy sezon goda / V. K. Golovanov, D. S. Kapshay, Yu. V. Gerasimov, I. L. Golovanova, D. P. Karabanov, A. K. Smirnov, I. V. Shlyapkin. Termoizbiranie i termoustoychivost' molodi goloveshki-rotana Perccottus glenii v osenniy sezon goda // Vopr. ihtiologii. 2013. T. 53, № 2. S. 227-232.
5. Golovanova I. L. Vliyanie prirodnyh i antropogennyh faktorov na gidroliz uglevodov u ryb i ob'ektov ih pitaniya / I. L. Golovanova: avtoref. dis.. d-ra biol. nauk. SPb.: IEFB im. I. M. Sechenova RAN, 2006. 43 s.
6. Golovanova I. L. Vliyanie gerbicida Raundap na aktivnost' glikozidaz molodi ryb i ih kormovyh ob'ektov pri razlichnyh znacheniyah temperatury i pH / I. L. Golovanova, A. I. Aminov // Vestn. Astrahan. gos. tehn. un-ta. Ser.: Rybnoe hozyaystvo. 2013. № 1. S. 129-134.
7. Glusczak L. Effect of glyphosate herbicide on acetylcholinesterase activity and metabolic and hematological parameters in piava (Leporinus obtusidens) / L. Glusczak, D. dos S. Miron, M. Crestani, M. B. Fonseca, F. de A. Pedron, M. F. Duarte, V. L. P. Vieira // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2006. Vol. 65. N 2. P. 237-241.
8. Ugolev A. M. Opredelenie aktivnosti invertazy i drugih disaharidaz / A. M. Ugolev, N. N. Iezuitova // Issledovanie pischevaritel'nogo apparata u cheloveka. L.: Nauka, 1969. S. 192-196.
9. Kapshay D. S. Verhnyaya letal'naya temperatura u molodi teplolyubivyh vidov ryb v zavisimosti ot temperatury akklimacii / D. S. Kapshay, V. K. Golovanov // Tr. Karel. NC RAN. Ser.: Eksperim. biologiya. 2013. № 3. S. 185-189.
10. Golovanova I. L. Vliyanie temperatury na aktivnost' pischevaritel'nyh karbogidraz rotana Perscottus glenii Dyb. v zimniy period / I. L. Golovanova, A. K. Smirnov, I. V. Shlyapkin // Biologiya vnutr. vod. 2009. № 2. S. 106-108.
