ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ И ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СЕГОЛЕТКОВ РОТАНА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ РАУНДАПА
Аннотация и ключевые слова
Аннотация (русский):
Изучено 30-суточное действие гербицида Раундап в концентрации 2 мкг/л (2 ПДК) на физиолого-биохимические и температурные характеристики молоди ротана Perccottus glenii. Установлено негативное влияние гербицида на амилолитическую активность в кишечнике рыб, особенно в условиях повышения температуры воды. Активность мальтазы не меняется, однако увеличение Km гидролиза мальтозы отражает снижение фермент-субстратного сродства при хроническом действии гербицида. Термоустойчивость рыб (по значению критического термического максимума) не меняется. Однако более высокие значения окончательно избираемой температуры свидетельствуют о влиянии Раундапа на терморегуляционное поведение рыб.

Ключевые слова:
ротан, пищеварительные гликозидазы, амилолитическая активность, мальтаза, окончательно избираемая температура, критический термический максимум, гербицид Раундап
Текст
Текст произведения (PDF): Читать Скачать

Введение Головешка-ротан Perccottus glenii для бассейна Верхней Волги является видом-вселенцем. Его нативный ареал расположен на Дальнем Востоке, в Китае и Северной Корее, в настоящее время он широко распространен в водоемах Северной Евразии [1]. Проявляя высокую адаптивность к действию природных и антропогенных факторов [2–4], ротан угнетающе действует на многие популяции аборигенных видов рыб. По температурным характеристикам (окончательно избираемой и верхней летальной температуре) ротан относится к наиболее теплолюбивым видам рыб, обитающих в пресных водоемах России [4]. Изучение активности пищеварительных ферментов выявило бóльшую устойчивость гликозидаз ротана к действию in vitro низкой температуры, кислых рН и ионов тяжелых металлов (медь, цинк), а также к действию высокой скорости нагрева воды по сравнению с рыбами сем. Cyprinidae [5]. В последние годы появились данные о негативном влиянии гербицида Раундап, широко применяемого для уничтожения сорной растительности в коллекторно-дренажных каналах, оросительных системах и прудах, на активность пищеварительных гликозидаз кишечника [6] и ацетилхолинэстеразы (АХЭ) мозга и мышц рыб [7]. Снижение активности АХЭ, играющей важную роль в синаптической передаче нервного импульса, приводит к нарушению поведения и ориентации рыб в пространстве [7] и, вероятно, может изменять терморегуляционное поведение рыб. Отметим, что действие загрязнителей органической природы на физиолого-биохимические показатели ротана и его температурные характеристики ранее не исследовалось. Цель работы состояла в изучении хронического действия гербицида Раундап на активность гликозидаз в кишечнике молоди ротана, а также его температурные характеристики. Материалы и методы исследования В ходе работы, выполненной в осенний период 2012 г., исследовались сеголетки ротана, отловленные в одном из прудов Некоузского района Ярославской области. В течение 1 месяца перед экспериментом рыб содержали в аквариумах вместимостью 200 л с постоянной аэрацией, 12-часовым периодом освещения, при температуре воды 15,5 ± 1 °С. Масса сеголетков составила 3,12 ± 0,17 г, длина тела – 5,44 ± 0,10 см. Затем рыб разделили на 2 группы: 50 экз. поместили в аквариум с чистой водой, 50 экз. – в аквариум с водой, содержащей Раундап в концентрации 2 мкг/л (2 ПДК). Смену воды в аквариумах производили 2 раза в неделю без отсадки рыб. По истечении 30 суток по 12 экз. из контрольной и опытной групп были взяты для определения активности пищеварительных гликозидаз, по 12 экз. были помещены в термоградиент (с диапазоном значений температуры от 14 до 31 ºС) для определения окончательно избираемой температуры (ОИТ), по 12 экз. были посажены в аквариумы, температуру воды в которых повышали со скоростью 8 ºС/ч до потери рыбами равновесия (переворот на бок), сублетальное значение температуры фиксировали как критический термический максимум (КТМ). В качестве критерия ОИТ была выбрана среднесуточная избираемая температура, значение которой в течение 3-х суток варьирует незначительно (р > 0,05). Более подробно методика определения температурных характеристик описана в [4]. В период акклимации, во время эксперимента с Раундапом и в условиях термоградиента рыб кормили 1 раз в сутки личинками хирономид из расчёта 4 % от общей массы тела. Активность гликозидаз (мальтаза и амилолитическая активность) определяли в гомогенатах медиального отдела кишечника. Амилолитическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал (a-амилаза КФ 3.2.1.1, глюкоамилаза КФ 3.2.1.3 и мальтаза КФ 3.2.1.20) оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [8]. Для определения активности мальтазы применяли набор для клинической биохимии «Фотоглюкоза» (ООО «Импакт», Россия). Ферментативную активность выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 минуту инкубации ферментативно-активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани, мкмоль/(г × мин). Кинетические характеристики гидролиза мальтозы - значения кажущейся константы Михаэлиса Km и максимальной скорости реакции V – определяли графическим методом Лайнуивера – Берка. Для приготовления раствора токсиканта (2 мкг/л) использовали коммерческий препарат гербицида, имеющий торговое название «Раундап» (произведен и расфасован ЗАО «Август» (Россия) по лицензии фирмы «Монсанто Европа С. А.» (Бельгия)). При определении чувствительности гликозидаз к действию Раундапа in vitro гомогенаты предварительно инкубировали в присутствии токсиканта в течение 60 минут. Концентрации Раундапа, рассчитанные по содержанию глифосата, составляли 0,1; 1; 10; 25 и 50 мкг/л. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M ± m). Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Через 30 суток действия Раундапа в концентрации 2 мкг/л масса и длина тела рыб контрольной и опытной групп достоверно не различались (табл. 1). Хроническое действие гербицида снижает амилолитическую активность в кишечнике ротана на 27 % по сравнению с рыбами контрольной группы. Активность мальтазы и максимальная скорость реакции гидролиза мальтозы у рыб опытной группы достоверно не изменяются. В то же время значения Km гидролиза мальтозы возрастают на 37 %, отражая снижение фермент-субстратного сродства при хроническом действии низких концентраций Раундапа. После 30-ти суток действия гербицида чувствительность гликозидаз к действию Раундапа in vitro снижается (табл. 2). Так, торможение амилолитической активности в кишечнике у рыб контрольной группы в присутствии Раундапа в концентрации 0,1–50 мкг/л составило 47–64 %, а у рыб опытной группы – лишь 13–21 % от контроля. Зависимости величины эффекта от концентрации гербицида не выявлено. Таблица 1 Физиолого-биохимические характеристики ротана контрольной и опытной групп после 30 суток воздействия Раундапом в концентрации 2 мкг/л Показатель Контроль Опыт Масса рыб, г 4,86 ± 0,48 5,07 ± 0,39 Длина тела, см 6,10 ± 0,15 6,17 ± 0,13 Амилолитическая активность, мкмоль/(г × мин) 5,56 ± 0,07 4,06 ± 0,06* Активность мальтазы, мкмоль/(г × мин) 6,21 ± 0,15 5,95 ± 0,08 V гидролиза мальтозы, мкмоль/(г×мин) 8,03 ± 0,12 8,01 ± 0,10 Km гидролиза мальтозы, ммоль/л 8,99 ± 0,24 12,3 ± 0,31* Амилолитическая активность после ОИТ и КТМ, мкмоль/(г × мин) 2,70 ± 0,08 1,73 ± 0,24* Активность мальтазы после ОИТ и КТМ, мкмоль/(г × мин) 5,01 ± 0,15 5,56 ± 0,06* Активность мальтазы после КТМ, мкмоль/(г × мин) 5,11 ± 0,21 6,92 ± 0,22* * Различия показателей у рыб опытной и контрольной групп статистически достоверны, р < 0,05. Таблица 2 Чувствительность гликозидаз к действию Раундапа in vitro* Группа Концентрация Раундапа, мкг/л 0 0,1 1 10 25 50 Контроль 4,69 ± 0,10а 1,97 ± 0,08в 1,71 ± 0,11в 1,73 ± 0,17в 1,92 ± 0,11в 2,51 ± 0,17б Опыт 2,82 ± 0,11а 2,45 ± 0,04б 2,44 ± 0,02б,в 2,22 ± 0,10в 2,38 ± 0,07б,в 2,39 ± 0,08б,в * Разные надстрочные индексы указывают на статистически достоверные различия между показателями в каждой строке (ANOVA, LSD-тест), p < 0,05. По истечении 30 суток опыта по 12 рыб из обеих групп отсадили в отсек термоградиента с температурой 15 ºС и предоставили им возможность свободного температурного выбора. По-видимому, в первые несколько суток, когда устойчивых различий в выборе температуры не наблюдается, происходит адаптация организма к новым условиям в градиенте (рис.). В то же время с 5-х по 9-е сутки значения ОИТ у рыб опытной группы были стабильно выше (24,4 ± 0,1 °С) по сравнению с рыбами контрольной группы (22,3 ± 0,1 °С), р < 0,0002. Эти данные свидетельствует о кратковременном влиянии гербицида на терморегуляционное поведение рыб, а выбор более высокой температуры может быть обусловлен необходимостью ускорения процессов метаболизма для вывода токсиканта из организма. Затем различия в уровне избираемой температуры сглаживаются, и на 12-е сутки они составили 24,0 ± 0,5 и 23,9 ± 0,3 ºС у рыб контрольной и опытной групп соответственно. Избираемая температура у молоди ротана контрольной и опытной групп после 30-и суток действия Раундапа в концентрации 2 мкг/л Термоустойчивость ротана после 30-и суток действия Раундапа не меняется, о чем свидетельствует равенство значений КТМ у рыб контрольной (31,3 ± 0,1 ºС) и опытной (31,0 ± 0,2 ºС) групп. После 12-суточного пребывания рыб в термоградиенте значения КТМ были достоверно выше: 35,9 ± 0,42 и 36,4 ± 0,37 ºС, что хорошо согласуется с данными о повышении значений КТМ с ростом температуры акклимации [9], но они также не различались у рыб контрольной и опытной групп. У рыб опытной группы, находившихся в термоградиенте и затем подверженных нагреву, амилолитическая активность на 36 % меньше по сравнению с амилолитической активностью рыб контрольной группы (см. табл. 1). Активность мальтазы у рыб опытной группы, наоборот, выше на 11 %. Кроме того, у ротана опытной группы при нагреве без нахождения в термоградиенте она также выше на 35 %. Ранее, при исследовании взрослых особей ротана, было показано, что повышение температуры воды в зимний период со скоростью 10 °С/ч снижает амилолитическую активность в 1,5 раза, негативно влияя на скорость гидролиза углеводов [10]. У рыб контрольной группы, находившихся в термоградиенте и затем подверженных нагреву, амилолитическая активность снижается на 51 %, активность мальтазы – на 20 %, у рыб опытной группы – на 57 и 7 % соответственно по сравнению с ферментативной активностью, измеренной сразу после 30-и суток действия Раундапа. Наибольшее снижение амилолитической активности – на 69 % от контроля – показано у рыб после хронического действия Раундапа, последующего нахождения в термоградиенте и последующего нагрева. Активность мальтазы снижается лишь на 10 %. Эти данные свидетельствует о негативном влиянии хронического действия Раундапа на суммарную активность ферментов, расщепляющих полисахарид крахмал, которое усиливается с повышением температуры воды, а также о разном влиянии скорости нагрева воды на активность панкреатических (a-амилаза, входящая в состав ферментов, гидролизующих крахмал) и собственно мембранных (мальтаза) ферментов. Заключение Полученные результаты свидетельствуют о негативном влиянии хронического действия гербицида Раундап (2 мкг/л) на амилолитическую активность в кишечнике молоди ротана. Активность мальтазы не меняется, однако увеличение Km гидролиза мальтозы отражает снижение фермент-субстратного сродства при хроническом действии гербицида. Хроническое действие Раундапа снижает чувствительность гликозидаз к in vitro действию гербицида. Термоустойчивость рыб (по КТМ) при 30-суточном действии гербицида не меняется. Однако значения ОИТ на 2 ºС выше по сравнению с контролем, что свидетельствует о влиянии Раундапа на терморегуляционное поведение рыб. Повышение температуры воды со скоростью 8 ºС/ч усиливает негативный эффект хронического действия Раундапа на амилолитическую активность.
Список литературы

1. Решетников А. Н. Современный ареал ротана Perccottus glenii Dybowski, 1877 (Odontobutidae, Pisces) в Евразии / А. Н. Решетников // Российский журнал биологических инвазий. 2009. № 3. С. 22-35.

2. Голованова И. Л. Влияние температуры на активность пищеварительных карбогидраз ротана Perccottus glenii Dyb. в зимний период / И. Л. Голованова, А. К. Смирнов, И. В. Шляпкин // Биол. внутр. вод. 2009. № 2. С. 90–92.

3. Каранова М. В. Состав свободных аминокислот крови и мышц ротана Perccottus glehni в период подготовки и завершения гибернации / М. В. Каранова // Журнал эволюц. биохимии и физиол. 2009. Т. 45, № 1. С. 59–67.

4. Голованов В. К. Термоизбирание и термоустойчивость молоди головешки-ротана Perccottus glenii в осенний сезон года / В. К. Голованов, Д. С. Капшай, Ю. В. Герасимов, И. Л. Голованова, Д. П. Карабанов, А. К. Смирнов, И. В. Шляпкин. Термоизбирание и термоустойчивость молоди головешки-ротана Perccottus glenii в осенний сезон года // Вопр. ихтиологии. 2013. Т. 53, № 2. С. 227–232.

5. Голованова И. Л. Влияние природных и антропогенных факторов на гидролиз углеводов у рыб и объектов их питания / И. Л. Голованова: автореф. дис.. д-ра биол. наук. СПб.: ИЭФБ им. И. М. Сеченова РАН, 2006. 43 с.

6. Голованова И. Л. Влияние гербицида Раундап на активность гликозидаз молоди рыб и их кормовых объектов при различных значениях температуры и pH / И. Л. Голованова, А. И. Аминов // Вестн. Астрахан. гос. техн. ун-та. Сер.: Рыбное хозяйство. 2013. № 1. С. 129–134.

7. Glusczak L. Effect of glyphosate herbicide on acetylcholinesterase activity and metabolic and hematological parameters in piava (Leporinus obtusidens) / L. Glusczak, D. dos S. Miron, M. Crestani, M. B. Fonseca, F. de A. Pedron, M. F. Duarte, V. L. P. Vieira // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2006. Vol. 65. N 2. P. 237–241.

8. Уголев А. М. Определение активности инвертазы и других дисахаридаз / А. М. Уголев, Н. Н. Иезуитова // Исследование пищеварительного аппарата у человека. Л.: Наука, 1969. С. 192-196.

9. Капшай Д. С. Верхняя летальная температура у молоди теплолюбивых видов рыб в зависимости от температуры акклимации / Д. С. Капшай, В. К. Голованов // Тр. Карел. НЦ РАН. Сер.: Эксперим. биология. 2013. № 3. С. 185–189.

10. Голованова И. Л. Влияние температуры на активность пищеварительных карбогидраз ротана Perсcottus glenii Dyb. в зимний период / И. Л. Голованова, А. К. Смирнов, И. В. Шляпкин // Биология внутр. вод. 2009. № 2. С. 106-108.