Россия
Россия
Цель работы – в контексте разработки методики криоконсервации исследовать взаимодействие воды с первичными оболочками яйцеклеток рыб как сигнала к их перестройке. Объектом для исследования служили репродуктивные клетки стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758), полученные в период нерестовой кампании. Вода – основной активатор функций репродуктивных клеток рыб – при контакте с первичными оболочками икры (двумя желточными и поверхностной студенистой) запускает механизм, изменяющий структуру и функциональную деятельность яйцеклеток, стимулирует подготовку яйцеклеток к оплодотворению, провоцируя перестройку органелл и изменения в оболочках. Последние при контакте с водой активируются и, вне зависимости от факта оплодотворения, приобретают различные свойства (клейкость, плавучесть, увеличение прочности), необходимые для дальнейшего развития эмбрионов в зависимости от условий инкубации. Изменения в свойствах оболочек обусловлены наличием определенных жирных кислот, дальнейшие химические превращения которых и являются основным фактором изменений согласно биологии размножения
яйцеклетка, стерлядь, оболочка, жирные кислоты, вода, криоконсервация
Введение В настоящее время становятся все более актуальными не только формирование живых ге-нофондных коллекций, но и сохранение генетического материала в виде глубокозамороженных спермиев, эмбрионов/предличинок в криобанках [1, 2]. Несмотря на то, что яйцеклетки или эмбрионы рыб, как было показано учеными, выжи-вают в течение короткого времени при охлаждении до нулевых температур, успешная глубокая их заморозка – очень редкое явление. Выделяют два основных препятствия для криоконсерва-ции яйцеклеток и эмбрионов рыб: во-первых, низкая проницаемость мембран, что затрудняет удаление воды из клетки, а также проникновение криозащитных агентов; во-вторых, большая желтковая масса ооцита и раннего эмбриона. Обе эти особенности приводят к образованию кри-сталлов льда в процессе замораживания [3]. Изучение строения клеток и их оболочек, видоспецифических различий очень важно для понимания реакции оболочек на водные растворы и моделирования возможных реакций при двойном температурном шоке при криоконсервации. При разработке методов криоконсервации яйцеклеток нельзя недооценивать роль внешней и внутриклеточной воды. Российские и зарубежные исследователи внесли свой вклад в описание внешнего строе-ния оболочки яйцеклеток осетровых с применением световой микроскопии [4–7]. Структура оболочки и микропиле были описаны у белуги Huso huso, русского осетра Acipenser gueldenstaedtii, сибирского осетра Acipenser baerii, севрюги Acipenser stellatus, стерляди Acipenser ruthenus [4–5, 8–11], белого осетра Acipenser transmontanus и адриатического осетра Acipenser naccarii [12, 13], а также веслоноса Polyodon spathula [14]. Перед нерестом яйцеклетки, формирующиеся в яичниках осетровых рыб, растут и созрева-ют. Каждая яйцеклетка окружена слоем фолликулярных клеток, непосредственно питающих яйцо. В течение периода созревания яйцеклетки накапливают большое количество желтка, который будет питать эмбрион во время развития до тех пор, пока личинки не перейдут на экзогенное питание. В течение продолжительного периода роста яйцеклетки ядро располагается в центре. Когда яйцеклетка приближается к своему финальному процессу созревания, ядро мигрирует от центра к анимальному полюсу, чтобы помочь генетическому материалу яйцеклетки легко смешаться с материалом спермы во время оплодотворения. Как только ооциты созревают, они отрываются от окружающего их фолликулярного слоя. Освободившиеся (овулировавшие) яйцеклетки стекают по трубкам и высвобождаются за пределы полости тела самки (нерест) и оплодотворяются. Овулированный ооцит покрыт оболочкой (хорионом), которая при воздействии воды набухает и затвердевает, защищая зародыш внутри. Кроме того, из хориона выделяется вещество, похожее на желе, которое позволяет ооцитам прилипать к субстрату на дне реки [15]. Целью работы было исследование взаимодействия воды с первичными оболочками яйце-клеток рыб как сигнала к их перестройке, что является важным для разработки методики криоконсервации. Материалы и методы Для изучения строения нативных оболочек яйцеклеток рыб использовали икру стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758). Нативные яйцеклетки обезвоживали в спиртах возрастаю-щей крепости, для чего последовательно использовали 50, 60, 70, 90, 96 и 100 оС спирт. После обезвоживания материал переносили в парафин. Для этого объекты помещали в термостат сна-чала в кашицу (смесь равных частей хлороформа и парафина) при температуре 37 оС, а затем в две-три порции чистого парафина, расплавленного при температуре 56 оС. Пропитанные па-рафином кусочки наклеивали на деревянные блоки. Для приготовления срезов использовали микротом. Полученные парафиновые срезы наклеивали на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином (1 : 1) и подсушивали в термостате при 37 оС. Для того чтобы удалить пара-фин, перед окрашиванием срезы последовательно провели через три порции О-ксилола, спирты нисходящей крепости (от 100 до 70 оС) и поместили в дистиллированную воду. Готовые препа-раты смотрели на микроскопе Olympus BX53 с использованием камеры для микроскопа Olympus XC50 (рис. 1). а б Рис. 1. Микроскоп Olympus BX53 с камерой Olympus XC50 (а) и препараты срезов икры (б) Результаты и их обсуждение При изучении оболочек нативных яйцеклеток осетровых рыб на примере стерляди обна-ружено, что под фолликулярным эпителием ооцит покрыт яйцевыми оболочками – двумя жел-точными и поверхностной студенистой (рис. 2). Рис. 2. Оболочка ооцита стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758): 1 – фолликулярный эпителий; 2 – студенистая оболочка (хорион); 3 – наружная желточная оболочка; 4 – внутренняя желточная оболочка; 5 – кортикальный слой; 6 – кортикальные гранулы Хорион (студенистая оболочка) имеется только у клейкой икры и располагается поверх лучистой оболочки, он состоит из белков и кислых и нейтральных мукополисахаридов. Кислые мукополисахариды, локализованные по внешнему краю либо в кончиках ворсинок, гидратиру-ясь в воде, становятся липкими, благодаря чему икра приклеивается к субстрату [12, 16, 17]. При работе с нативной икрой отчетливо видны обе желточные оболочки, вероятно, в силу различной степени их растяжения. Позже, после попадания яйцеклетки в воду и при дальней-шем оплодотворении, желточные оболочки плотно прилегают друг к другу, поэтому могут быть приняты за одну (рис. 3). Вода в первую очередь контактирует с плазмолеммой и мембранами первичных оболочек, от проницаемости которых зависит как количество проникшей внутрь воды, так и путь проис-хождения энергии на обеспечение необходимых реакций. Перестройки органелл и дальнейшее дробление, которые начинаются внутри клеток у разных видов рыб после активации водой, идентичны. Однако изменение первичной оболочки яйцеклеток у разных видов рыб различно: у некоторых появляется клейкость (белуга, карп), а другие набухают и увеличиваются в разме-рах в несколько раз (толстолобик). Разные экологические условия развития икры отразились на строении яйцеклеток и ха-рактерных особенностях, заключающихся в химическом составе органелл клеток, что, по-видимому, определяется наличием определенных жирных кислот, дальнейшие хими-ческие превращения которых и являются основным фактором изменений клеток согласно био-логии размножения (табл.). Рис. 3. Оболочка оплодотворенной яйцеклетки стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758): 1 – полость гаструлы; 2 – желточная оболочка; 3 – студенистая оболочка (хорион) Состав жирных кислот первичных оболочек рыб* Тип икры Состав первичных оболочек Икра в буграх (лососевые) Насыщенные кислоты 18,26 %, мононенасыщенные + полиненасыщенные 81,74 % Приклеивающаяся икра (сазан) Насыщенные 36,18 %, мононенасыщенные 35,02 %, полиненасыщенные 28,8 % кислоты Плавающая икра (толстолобик) Моноеновые кислоты 36,8 %, насыщенные кислоты 42 %, полиненасыщенные 21,2 % *Составлено по [18]. Так, для икры, развивающейся в буграх (лососевые), характерно наличие пальмитиновой и олеиновой кислот, которые при взаимодействии с водой переходят в стеариновую кислоту, не растворимую в воде и способствующую повышению прочности первичных оболочек. Моно-еновые кислоты вызывают внутренние перестройки в клетке, а именно концентрацию жировых вакуолей в районе микропиле. Вследствие такой перестройки яйцеклетка обретает плавучесть и пространственную ориентацию (микропиле вверх). Таким образом, вода при контакте с обо-лочками клеток запускает механизм, который изменяет структуру и функциональную их дея-тельность в зависимости от дальнейшего развития эмбриона. Заключение По результатам проведенного исследования можно сделать вывод, что вода – основной активатор функций репродуктивных клеток рыб. При контакте с первичными оболочками икры она запускает механизм, изменяющий структуру и функциональную направленность яйцекле-ток. При разработке протоколов криоконсервации очень важно учитывать реакцию оболочек клеток на воду, т. к. от этого фактора также зависит успех процедуры. Вода стимулирует подго-товку яйцеклеток к оплодотворению, провоцируя перестройку органелл внутри них и в оболоч-ках для дальнейшего обеспечения оптимальных условий развития эмбриона. Оболочки при кон-такте с водой активируются и, вне зависимости от факта оплодотворения, приобретают различ-ные свойства (клейкость, плавучесть, увеличение прочности), необходимые для дальнейшего развития эмбрионов в зависимости от условий инкубации. Изменения в свойствах оболочек обусловлены наличием определенных жирных кислот.
1. Пономарева Е. Н., Красильникова А. А., Тихомиров А. М., Фирсова А. В. Новые биотехнологические методы криоконсервации репродуктивных клеток осетровых видов рыб // Юг России: экология, развитие. 2016. Т. 11. № 1. С. 59-68.
2. Пономарева Е. Н., Красильникова А. А., Фирсова А. В., Белая М. М. Криоконсервация репродуктивных клеток рыб: история и перспективы // Рыбное хозяйство. 2017. № 4. С. 85-88.
3. Rawson D. M., Zhang T. New approaches to the cryopreservation of fish oocytes and embryos // The role of biotechnology. Villa Gualino, Turin, Italy. 2005. P. 209-210.
4. Детлаф Т. А., Гинзбург А. С., Шмальгаузен О. И. Развитие осетровых рыб. Созревание яиц, оплодотворение, развитие зародышей и предличинок. М.: Наука, 1981. 224 с.
5. Марков К. П. Изучение микроструктуры оболочки яиц русского осетра Acipenser guldenstadti В. с помощью электронного сканирующего микроскопа // Вопросы ихтиологии. 1975. Т. 15. Вып. 5. С. 822-832.
6. Doroshov S. I., Moberg G. P., Van Eenennaam J. P. Observations on the reproductive cycle of cultured white sturgeon, Acipenser transmontanus // Environmental Biology of Fishes. 1997. V. 48. P. 265-278.
7. Siddique M. A. M., Cosson J., Psenicka M., Linhart O. A review of the structure of sturgeon egg membranes and of the associated terminology // Journal of Applied Ichthyology. 2014. V. 30 (6). P. 1246-1255.
8. Le Menn F., Pelissero C. Histological and ultrastructural studies of the Siberian sturgeon Acipenser baerii // Acipenser. P. Williot (Ed.). Cemagref Publ., Springer, Netherlands, 1991. P. 113-127.
9. Debus L., Winkler M., Billard R. Structure of micropyle surface on oocytes and caviar grains in sturgeons // International Review of Hydrobiology. 2002. V. 87. P. 585-603.
10. Psenicka M., Rodina, M., Linhart O. Ultrastructural study on the fertilisation process in sturgeon (Acipenser), function of acrosome and prevention of polyspermy // Animal Reproduction Science. 2010. V. 117. P. 147-154.
11. Zelazowska M. Formation and structure of egg envelopes in Russian sturgeon Acipenser gueldenstaedtii (Acipenseriformes: Acipenseridae) // Journal of Fish Biology. 2010. V. 76. P. 694-706.
12. Cherr G. N., Clark W. H. Fine structure of the envelope and micropyles in the eggs of the white sturgeon Acipenser transmontanus Richardson // Development, Growth and Differentiation. 1982. V. 24. P. 341-352.
13. Spinaci L., Lamia L. C., Cataudella S., Cotteli F. Preliminary contribution to the study of structural modifications of egg envelope during embryogenesis in Acipenser naccarii // Journal of Applied Ichthyology. 1999. V. 15. P. 320-321.
14. Linhart O., Kudo S. Surface ultrastructure of paddlefish eggs before and after fertilization // Journal of Fish Biology. 1997. V. 51. P. 573-582.
15. Frank A. Ch., Joel P., Eenennaam V. Technically Speaking, What Is Sturgeon Caviar? // University of Florida IFAS Extension. 2016. P. 1-5.
16. Макеева А. П., Микодина Е. В. Строение яйцевых оболочек карповых рыб и некоторые данные об их химической природе // Науч. докл. высш. шк. Биолог. науки. 1977. № 9 (165). С. 60-64.
17. Микодина Е. В. О структуре поверхности оболочек икринок костистых рыб // Вопр. ихтиологии. 1987. Т. 27. Вып. 1. С. 106-113.
18. Лебская Т. К., Менчинская А. А. Сравнительная характеристика пищевой ценности икры некоторых рыб // Вестн. науки и образования Северо-Запада России. 2015. Т. 1. № 2. С. 1-7.
