Russian Federation
Russian Federation
The article outlines studying the interaction of water with the primary membranes of fish eggs as a signal for their restructuring, which is important for developing the cryopreservation techniques. The reproductive cells of sterlet (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758) obtained during the spawning campaign served as the object of research. Water as a main activator of the functions of fish reproductive cells contacting with primary membranes of eggs (two yellows and one surface jelly-like) triggers a mechanism that changes the structure and functional activity of eggs, stimulates the preparation of eggs for fertilization, provoking the rearrangement of organelles and changes in the membranes. The latter are activated contacting with water and, regardless of the fact of fertilization, acquire various properties (stickiness, buoyancy, increased strength) necessary for the further development of embryos, depending on the conditions of incubation. Changes in the properties of the membranes are stipulated by the presence of certain fatty acids, further chemical transformations of which are the main factor of their changes, according to the biology of reproduction.
egg cell, sterlet, mebrane, fatty acids, water, cryopreservation
Введение В настоящее время становятся все более актуальными не только формирование живых ге-нофондных коллекций, но и сохранение генетического материала в виде глубокозамороженных спермиев, эмбрионов/предличинок в криобанках [1, 2]. Несмотря на то, что яйцеклетки или эмбрионы рыб, как было показано учеными, выжи-вают в течение короткого времени при охлаждении до нулевых температур, успешная глубокая их заморозка – очень редкое явление. Выделяют два основных препятствия для криоконсерва-ции яйцеклеток и эмбрионов рыб: во-первых, низкая проницаемость мембран, что затрудняет удаление воды из клетки, а также проникновение криозащитных агентов; во-вторых, большая желтковая масса ооцита и раннего эмбриона. Обе эти особенности приводят к образованию кри-сталлов льда в процессе замораживания [3]. Изучение строения клеток и их оболочек, видоспецифических различий очень важно для понимания реакции оболочек на водные растворы и моделирования возможных реакций при двойном температурном шоке при криоконсервации. При разработке методов криоконсервации яйцеклеток нельзя недооценивать роль внешней и внутриклеточной воды. Российские и зарубежные исследователи внесли свой вклад в описание внешнего строе-ния оболочки яйцеклеток осетровых с применением световой микроскопии [4–7]. Структура оболочки и микропиле были описаны у белуги Huso huso, русского осетра Acipenser gueldenstaedtii, сибирского осетра Acipenser baerii, севрюги Acipenser stellatus, стерляди Acipenser ruthenus [4–5, 8–11], белого осетра Acipenser transmontanus и адриатического осетра Acipenser naccarii [12, 13], а также веслоноса Polyodon spathula [14]. Перед нерестом яйцеклетки, формирующиеся в яичниках осетровых рыб, растут и созрева-ют. Каждая яйцеклетка окружена слоем фолликулярных клеток, непосредственно питающих яйцо. В течение периода созревания яйцеклетки накапливают большое количество желтка, который будет питать эмбрион во время развития до тех пор, пока личинки не перейдут на экзогенное питание. В течение продолжительного периода роста яйцеклетки ядро располагается в центре. Когда яйцеклетка приближается к своему финальному процессу созревания, ядро мигрирует от центра к анимальному полюсу, чтобы помочь генетическому материалу яйцеклетки легко смешаться с материалом спермы во время оплодотворения. Как только ооциты созревают, они отрываются от окружающего их фолликулярного слоя. Освободившиеся (овулировавшие) яйцеклетки стекают по трубкам и высвобождаются за пределы полости тела самки (нерест) и оплодотворяются. Овулированный ооцит покрыт оболочкой (хорионом), которая при воздействии воды набухает и затвердевает, защищая зародыш внутри. Кроме того, из хориона выделяется вещество, похожее на желе, которое позволяет ооцитам прилипать к субстрату на дне реки [15]. Целью работы было исследование взаимодействия воды с первичными оболочками яйце-клеток рыб как сигнала к их перестройке, что является важным для разработки методики криоконсервации. Материалы и методы Для изучения строения нативных оболочек яйцеклеток рыб использовали икру стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758). Нативные яйцеклетки обезвоживали в спиртах возрастаю-щей крепости, для чего последовательно использовали 50, 60, 70, 90, 96 и 100 оС спирт. После обезвоживания материал переносили в парафин. Для этого объекты помещали в термостат сна-чала в кашицу (смесь равных частей хлороформа и парафина) при температуре 37 оС, а затем в две-три порции чистого парафина, расплавленного при температуре 56 оС. Пропитанные па-рафином кусочки наклеивали на деревянные блоки. Для приготовления срезов использовали микротом. Полученные парафиновые срезы наклеивали на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином (1 : 1) и подсушивали в термостате при 37 оС. Для того чтобы удалить пара-фин, перед окрашиванием срезы последовательно провели через три порции О-ксилола, спирты нисходящей крепости (от 100 до 70 оС) и поместили в дистиллированную воду. Готовые препа-раты смотрели на микроскопе Olympus BX53 с использованием камеры для микроскопа Olympus XC50 (рис. 1). а б Рис. 1. Микроскоп Olympus BX53 с камерой Olympus XC50 (а) и препараты срезов икры (б) Результаты и их обсуждение При изучении оболочек нативных яйцеклеток осетровых рыб на примере стерляди обна-ружено, что под фолликулярным эпителием ооцит покрыт яйцевыми оболочками – двумя жел-точными и поверхностной студенистой (рис. 2). Рис. 2. Оболочка ооцита стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758): 1 – фолликулярный эпителий; 2 – студенистая оболочка (хорион); 3 – наружная желточная оболочка; 4 – внутренняя желточная оболочка; 5 – кортикальный слой; 6 – кортикальные гранулы Хорион (студенистая оболочка) имеется только у клейкой икры и располагается поверх лучистой оболочки, он состоит из белков и кислых и нейтральных мукополисахаридов. Кислые мукополисахариды, локализованные по внешнему краю либо в кончиках ворсинок, гидратиру-ясь в воде, становятся липкими, благодаря чему икра приклеивается к субстрату [12, 16, 17]. При работе с нативной икрой отчетливо видны обе желточные оболочки, вероятно, в силу различной степени их растяжения. Позже, после попадания яйцеклетки в воду и при дальней-шем оплодотворении, желточные оболочки плотно прилегают друг к другу, поэтому могут быть приняты за одну (рис. 3). Вода в первую очередь контактирует с плазмолеммой и мембранами первичных оболочек, от проницаемости которых зависит как количество проникшей внутрь воды, так и путь проис-хождения энергии на обеспечение необходимых реакций. Перестройки органелл и дальнейшее дробление, которые начинаются внутри клеток у разных видов рыб после активации водой, идентичны. Однако изменение первичной оболочки яйцеклеток у разных видов рыб различно: у некоторых появляется клейкость (белуга, карп), а другие набухают и увеличиваются в разме-рах в несколько раз (толстолобик). Разные экологические условия развития икры отразились на строении яйцеклеток и ха-рактерных особенностях, заключающихся в химическом составе органелл клеток, что, по-видимому, определяется наличием определенных жирных кислот, дальнейшие хими-ческие превращения которых и являются основным фактором изменений клеток согласно био-логии размножения (табл.). Рис. 3. Оболочка оплодотворенной яйцеклетки стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758): 1 – полость гаструлы; 2 – желточная оболочка; 3 – студенистая оболочка (хорион) Состав жирных кислот первичных оболочек рыб* Тип икры Состав первичных оболочек Икра в буграх (лососевые) Насыщенные кислоты 18,26 %, мононенасыщенные + полиненасыщенные 81,74 % Приклеивающаяся икра (сазан) Насыщенные 36,18 %, мононенасыщенные 35,02 %, полиненасыщенные 28,8 % кислоты Плавающая икра (толстолобик) Моноеновые кислоты 36,8 %, насыщенные кислоты 42 %, полиненасыщенные 21,2 % *Составлено по [18]. Так, для икры, развивающейся в буграх (лососевые), характерно наличие пальмитиновой и олеиновой кислот, которые при взаимодействии с водой переходят в стеариновую кислоту, не растворимую в воде и способствующую повышению прочности первичных оболочек. Моно-еновые кислоты вызывают внутренние перестройки в клетке, а именно концентрацию жировых вакуолей в районе микропиле. Вследствие такой перестройки яйцеклетка обретает плавучесть и пространственную ориентацию (микропиле вверх). Таким образом, вода при контакте с обо-лочками клеток запускает механизм, который изменяет структуру и функциональную их дея-тельность в зависимости от дальнейшего развития эмбриона. Заключение По результатам проведенного исследования можно сделать вывод, что вода – основной активатор функций репродуктивных клеток рыб. При контакте с первичными оболочками икры она запускает механизм, изменяющий структуру и функциональную направленность яйцекле-ток. При разработке протоколов криоконсервации очень важно учитывать реакцию оболочек клеток на воду, т. к. от этого фактора также зависит успех процедуры. Вода стимулирует подго-товку яйцеклеток к оплодотворению, провоцируя перестройку органелл внутри них и в оболоч-ках для дальнейшего обеспечения оптимальных условий развития эмбриона. Оболочки при кон-такте с водой активируются и, вне зависимости от факта оплодотворения, приобретают различ-ные свойства (клейкость, плавучесть, увеличение прочности), необходимые для дальнейшего развития эмбрионов в зависимости от условий инкубации. Изменения в свойствах оболочек обусловлены наличием определенных жирных кислот.
1. Ponomareva E. N., Krasil'nikova A. A., Tikhomirov A. M., Firsova A. V. Novye biotekhnologicheskie metody kriokonservatsii reproduktivnykh kletok osetrovykh vidov ryb [New biotechnological methods of cryopreservation of reproductive cells of sturgeon species]. Iug Rossii: ekologiia, razvitie, 2016, vol. 11, no. 1, pp. 59-68.
2. Ponomareva E. N., Krasil'nikova A. A., Firsova A. V., Belaia M. M. Kriokonservatsiia reproduk-tivnykh kletok ryb: istoriia i perspektivy [Cryopreservation of fish reproductive cells: history and prospects]. Rybnoe khoziaistvo, 2017, no. 4, pp. 85-88.
3. Rawson D. M., Zhang T. New approaches to the cryopreservation of fish oocytes and embryos. The role of biotechnology. Villa Gualino, Turin, Italy, 2005, pp. 209-210.
4. Detlaf T. A., Ginzburg A. S., Shmal'gauzen O. I. Razvitie osetrovykh ryb. Sozrevanie iaits, oplodotvorenie, razvitie zarodyshei i predlichinok [Sturgeon development. Maturation of eggs, fertilization, development of embryos and prelarvae]. Moscow, Nauka Publ., 1981. 224 p.
5. Markov K. P. Izuchenie mikrostruktury obolochki iaits russkogo osetra Acipenser guldenstadti V. s pomoshch'iu elektronnogo skaniruiushchego mikroskopa [Studying microstructure of egg shell of Russian sturgeon Acipenser guldenstadti V. using electron scanning microscope]. Voprosy ikhtiologii, 1975, vol. 15, iss. 5, pp. 822-832.
6. Doroshov S. I., Moberg G. P., Van Eenennaam J. P. Observations on the reproductive cycle of cultured white sturgeon, Acipenser transmontanus. Environmental Biology of Fishes, 1997, vol. 48, pp. 265-278.
7. Siddique M. A. M., Cosson J., Psenicka M., Linhart O. A review of the structure of sturgeon egg membranes and of the associated terminology. Journal of Applied Ichthyology, 2014, vol. 30 (6), pp. 1246-1255.
8. Le Menn F., Pelissero C. Histological and ultrastructural studies of the Siberian sturgeon Acipenser baerii. Acipenser. P. Williot (Ed.). Cemagref Publ., Springer, Netherlands, 1991. Pp. 113-127.
9. Debus L., Winkler M., Billard R. Structure of micropyle surface on oocytes and caviar grains in sturgeons. International Review of Hydrobiology, 2002, vol. 87, pp. 585-603.
10. Psenicka M., Rodina, M., Linhart O. Ultrastructural study on the fertilisation process in sturgeon (Acipenser), function of acrosome and prevention of polyspermy. Animal Reproduction Science, 2010, vol. 117, pp. 147-154.
11. Zelazowska M. Formation and structure of egg envelopes in Russian sturgeon Acipenser gueldenstaedtii (Acipenseriformes: Acipenseridae). Journal of Fish Biology, 2010, vol. 76, pp. 694-706.
12. Cherr G. N., Clark W. H. Fine structure of the envelope and micropyles in the eggs of the white sturgeon Acipenser transmontanus Richardson. Development, Growth and Differentiation, 1982, vol. 24, pp. 341-352.
13. Spinaci L., Lamia L. C., Cataudella S., Cotteli F. Preliminary contribution to the study of structural modifications of egg envelope during embryogenesis in Acipenser naccarii. Journal of Applied Ichthyology, 1999, vol. 15, pp. 320-321.
14. Linhart O., Kudo S. Surface ultrastructure of paddlefish eggs before and after fertilization. Journal of Fish Biology, 1997, vol. 51, pp. 573-582.
15. Frank A. Ch., Joel P., Eenennaam V. Technically Speaking, What Is Sturgeon Caviar? University of Florida IFAS Extension, 2016. Pp. 1-5.
16. Makeeva A. P., Mikodina E. V. Stroenie iaitsevykh obolochek karpovykh ryb i nekotorye dannye ob ikh khimicheskoi prirode [Structure of egg shells of cyprinids and data on their chemical nature]. Nauchnye doklady vysshei shkoly. Biologicheskie nauki, 1977, no. 9 (165), pp. 60-64.
17. Mikodina E. V. O strukture poverkhnosti obolochek ikrinok kostistykh ryb [On structure of egg shell surface of teleost fish]. Voprosy ikhtiologii, 1987, vol. 27, iss. 1, pp. 106-113.
18. Lebskaia T. K., Menchinskaia A. A. Sravnitel'naia kharakteristika pishchevoi tsennosti ikry nekotorykh ryb [Comparative characteristics of nutritional value of some fish eggs]. Vestnik nauki i obrazovaniia Severo-Zapada Rossii, 2015, vol. 1, no. 2, pp 1-7.
