Текст (PDF):
Читать
Скачать
Введение На фоне ухудшения экологических показателей водной среды, мощных антропогенных воздействий, приводящих к сокращению численности промысловых видов рыб, актуальным остается решение двух важнейших задач: пополнение запасов в естественных водоемах за счет выпуска жизнестойкой молоди и товарное выращивание в рыбоводных прудовых и бассейновых хозяйствах на основе пастбищного, комбинированного и индустриального выращивания [1, 2]. В настоящее время наиболее актуальными проблемами рыбоводства являются формирование маточных стад, выращивание жизнеспособной молоди, подбор условий выращивания, совершенствование рецептур искусственных кормов, создание новых пород и гибридов, более устойчивых к техногенным воздействиям [3, 4]. Мировой и отечественный опыт аквакультуры показывает, что перспективной является ориентация на новые интенсивные биотехнологии, предполагающие создание небольших по площади модульных систем с замкнутым циклом водоснабжения, требующих относительно небольших капитальных вложений, малый штат обслуживающего персонала, максимально автоматизированных, оснащенных современным оборудованием и новейшими технологиями [1, 2]. Эффективность товарного рыбоводства во многом зависит от состояния и качества получаемой молоди, ее жизнестойкости и физиологической полноценности и обусловлена обеспеченностью соответствующим набором живых кормов [5-7]. Отсутствие необходимого количества зоопланктона при индустриальном выращивании промысловых рыб привело к активным исследованиям по разработке искусственных кормов. При современных методах рыборазведения складываются несколько иные условия, отличные от естественных, что накладывает свой отпечаток на физиологическое состояние и некоторые биологические особенности рыб. Это, в свою очередь, требует постоянного контроля за процессом выращивания, оценки физиологического состояния и, при необходимости, его корректировки. До недавнего времени физиологическое состояние рыб оценивали в первую очередь по морфофизиологическим, гистологическим и гематологическим показателям, хотя биохимические показатели относятся к группе основных индикаторов состояния промысловых рыб. Для того чтобы проанализировать ответные реакции организма на действие факторов культивирования, используются биомаркеры - индикаторы разного биологического уровня (морфофизиологические параметры, патологические отклонения, состояние репродуктивной системы, генетические и биохимические характеристики). Известно, что пагубный эффект стрессового воздействия в первую очередь инициирует ответную реакцию клеточных систем, поэтому эти отклики являются наиболее чувствительными и информативными на ранних этапах негативного воздействия. Клеточные и молекулярные реакции имеют преимущество, т. к. отражают эффекты основных обменных процессов на клеточном уровне и могут служить ранними сигналами неблагоприятных последствий стресса, которые предшествуют видимому ухудшению общего состояния жизнедеятельности и соответствующих параметров, измеряемых на более высоких уровнях биологической организации. В то же время они позволяют определить механизмы адаптации и восстановления гомеостаза организма в условиях действия неблагоприятных факторов среды [8]. Биомаркеры низкой биологической иерархии (молекулярные и биохимические) отвечают на неблагоприятные воздействия значительно быстрее, чем индикаторы более высокого биологического уровня (физиологические, цитологические и организменные) и потому дают более эффективную оценку среды в качестве предвестников ее ухудшения [9]. Целью исследования являлось изучение влияния состава различных продукционных кормов и условий выращивания на биохимические показатели печени и состав мышечной ткани некоторых лососевых видов рыб. Материалы и методы исследования Биохимические исследования печени и спинных мышц проводили на кафедре биотехнологии Казахского национального университета им. аль-Фараби. Объектом исследований являлась молодь радужной форели (Oncorhynchus mykiss) и пеляди (Coregonus peled), выращенных с использованием разных кормов и технологий (табл. 1). Отбор аналитического материала проводили каждые 15 суток в течение 30 суток культивирования. В качестве контроля использовали пробы, взятые в начале эксперимента. Повторность пятикратная. Таблица 1 Морфометрические показатели молоди рыб, использованные в эксперименте Вид рыбы Место сбора, способ выращивания Вид корма Отбор Масса, г Длина, см Qпечени Q q L l Радужная форель РГКП* «Капшагайское нерестово-выростное хозяйство» (Алматинская обл.), бассейновая технология, прямоток Контроль 1 20,0 ± 1,5 17,0 ± 1,1 12,4 ± 0,6 10,7 ± 0,9 0,32 ± 0,05 КазНИИ ППП** 2 21,0 ± 1,3 16,8 ± 1,2 12,1 ± 1,7 10,6 ± 1,4 0,47 ± 0,01 3 35,3 ± 2,6 29,2 ± 2,1 14,9 ± 0,4 13,2 ± 0,4 0,65 ± 0,05 Aller Aqua 2 31,9 ± 2,7 26,8 ± 2,8 14,2 ± 0,9 12,5 ± 0,8 0,48 ± 0,01 3 43,1 ± 3,3 35,9 ± 2,1 15,3 ± 0,4 13,5 ± 0,3 0,82 ± 0,02 ТОО «Густера» (Восточно-Казахстанская область), садковая технология КазНИИ ППП 2 38,0 ± 3,3 30,2 ± 2,5 14, =9 ± 1,1 13,1 ± 1,7 0,50 ± 0,03 Aller Aqua 2 94,1 ± 12,5 76,5 ± 3,7 20,3 ± 1,3 17,9 ± 0,9 1,60 ± 0,05 Пелядь ТОО «Чепурной» (Северно-Казахстанская область), озерно-товарное рыбоводство Контроль 1 63,9 ± 3,1 58,5 ± 4,4 19,4 ± 0,8 16,2 ± 0,6 0,47 ± 0,09 КазНИИ ППП 2 61,9 ± 2,4 55,8 ± 4,2 19,2 ± 1,0 16,1 ± 1,1 0,51 ± 0,05 * Республиканское государственное казенное предприятие. ** Казахский научно-исследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности. Каждую особь после вылова измеряли, взвешивали, затем препарировали. Образцы печени и спинных мышц замораживали в жидком азоте при температуре -196 °С и хранили в сосуде Дюара для дальнейшей транспортировки. Сухое вещество определяли гравиметрическим методом, для этого пробы высушивали в сушильном шкафу в течение 2-х часов при температуре 105 °С до постоянной массы, взвешивали, после чего сжигали в муфельной печи при температуре 500 °С в течение 1 часа и снова взвешивали с абсолютной погрешностью не более 0,001 г. По разнице масс определяли в процентах массу органического вещества [10]. Определение массовой доли белка проводили биуретовым методом без минерализации проб [10]. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре Jenway 6405 UV/Vis (Jenway, Великобритания) в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 546 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы (дистиллированная вода). Расчет вели по калибровочному графику, в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (PAALaboratories, Австрия). Содержание гликогена определяли с антроном и фотометрировали при 620 нм [11]. Расчет вели по калибровочному графику, в качестве стандарта использовали глюкозу. Найденное количество глюкозы умножали на коэффициент 0,9, т. к. молекулярный вес глюкозного остатка в гликогене равен 162, а молекулярный вес глюкозы - 180. Массовую долю жира определяли ускоренным экстракционно-весовым методом, разработанным в Институте питания Академии медицинских наук СССР. Метод основан на растворении липидов бинарной смесью органических растворителей (хлороформ : этанол - 2:1), отделении растворителей и весовом определении массы липидов [12]. Активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) в микросомальной фракции печени [13] проводили динитрофенилгидрозоновым методом Рейтмана - Френкеля [14], измеряя оптическую плотность при 537 нм против холостой пробы, которую ставили как опыт, но сыворотку добавляли после инкубации. Расчет активности ферментов в сыворотке крови проводили по калибровочному графику. Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, где образовавшийся окрашенный триметиновый комплекс имеет максимум поглощения при 532 нм. При расчете использовал и коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса - 1,56 ∙ 105 [14]. Результаты исследования и их обсуждение Биохимический анализ печени молоди рыб при различных условиях выращивания Условно функции печени по биохимическим показателям можно разделить на регуляторно-гомеостатическую, включающую основные виды обмена (углеводный, липидный, белковый, обмен витаминов, водно-минеральный и пигментный обмены), мочевин образовательную, желчеобразовательную и обезвреживающую. В связи с этим для оценки биохимического состояния данного органа была получена микросомальная фракция, в которой было определено содержание общих белков, была определена активность таких ферментов, как аспартатаминотрансфераза (АсАТ) и аланинаминотрансфераза (АлАТ), а также количество общих липидов, гликогена, уровень перекисного окисления липидов в печеночной ткани. Из данных табл. 2 видно, что с увеличением срока культивирования содержание гликогена в печени молоди форели при бассейновой технологии повышается. Так, при использовании корма, разработанного сотрудниками КазНИИ ППП, содержание гликогена увеличилось с 0,83 ± 0,09 до 6,62 ± 0,3 мг/г сырой массы, при садковом выращивании масса гликогена составила 20,75 ± 1,6 мг/г сырой массы. На содержание гликогена в печени молоди форели вид применяемого корма не оказал достоверного влияния. Обнаружено низкое содержание гликогена в печени молоди пеляди на экспериментальном корме - 9,91 ± 2,1 мг/г сырой массы, в то время как на контрольных кормах количество гликогена равнялось 13,67 ± 1,8 мг/г сырой массы. Таблица 2 Содержание гликогена и общих липидов в печени молоди рыб при различных условиях выращивания Вид рыбы Место сбора Вид корма Отбор Содержание, мг/г сырой массы гликогена общих липидов Форель Бассейновая технология, прямоток Контроль 1 0,83 ± 0,1 24,1 ± 0,2 КазНИИ ППП 2 1,11 ± 0,1 61,3 ± 0,1 3 6,62 ± 0,3 68,4 ± 0,1 Aller Aqua 2 0,52 ± 0,2 55,3 ± 0,6 3 8,07 ± 0,2 55,6 ± 0,7 Садковая технология КазНИИ ППП 2 20,75 ± 1,6 39,5 ± 0,4 Aller Aqua 2 20,20 ± 2,8 43,5 ± 0,1 Пелядь Озерно-товарное рыбоводство Контроль 1 13,67 ± 1,8 56,4 ± 0,9 КазНИИ ППП 2 9,91 ± 2,1 54,4 ± 1,1 Одним из важнейших компонентов живого органического вещества являются липиды, в значительной степени определяющие структурно-функциональные особенности и энергетический потенциал как клетки, так и организма в целом. Количественный анализ общих липидов в печени молоди форели показал, что при бассейновой технологии выращивания их содержание повышается по сравнению с содержанием при выращивании с использованием садковой технологии (табл. 2). При использовании экспериментального корма КазНИИ ППП в первом случае количество общих липидов выросло почти в 3 раза - с 0,024 ± 0,002 до 0,068 ± 0,01 г/г сырой массы, во втором случае данный показатель увеличился меньше чем в 2 раза - до 0,040 ± 0,004 г/г сырой массы. Использование различных кормов в рационе отразилось на содержании липидов у молоди пеляди - в печени оказалось всего 0,056-0,054 г/г сырой массы. Среди многочисленных показателей липидного обмена процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) играют важную роль не только в физиолого-биохимическом гомеостазе нормальной клетки - они выступают как универсальное неспецифическое звено механизма развития различных патологических состояний организма. Обладая высокой реакционной способностью, первичные продукты ПОЛ повреждают различные биомолекулы, и в первую очередь белки. Это является основой их инактивирующего действия на многие ферменты. Однако в связи с неустойчивостью в организме первичных продуктов ПОЛ к их исследованиям прибегают редко. Предпочтение отдается определению концентрации более устойчивых вторичных и конечных продуктов ПОЛ, в частности МДА и соединений типа оснований Шиффа. В табл. 3 представлены данные по влиянию состава различных продукционных кормов и условий выращивания на концентрацию МДА в печени молоди исследуемых рыб. С увеличением сроков культивирования наблюдалось снижение содержания МДА в печени форели. Так, при использовании корма Aller Aqua показатели снизились с 11,5 ± 1,1 до 1,9 ± 0,1 мкмоль/г сырой массы при использовании бассейновой технологии и до 2,9 ± 0,7 мкмоль/г сырой массы при садковом выращивании. У пеляди использование экспериментальных кормов приводило к повышению содержания МДА в печени - 37,7 ± 2,1 мкмоль/г сырой массы, в то время как в контроле - в 1,6 раза меньше (24,3 ± 1,3 мкмоль/г сырой массы). Повышение концентрации МДА свидетельствует об активации процессов ПОЛ или о снижении антиоксидантной защиты организма. Таблица 3 Концентрация малонового диальдегида в печени молоди рыб при различных условиях выращивания Вид рыб Место сбора Вид корма Отбор Содержание МДА, мкмоль/г сырой массы Форель Бассейновая технология, прямоток Контроль 1 11,5 ± 1,1 КазНИИ ППП 2 4,5 ± 0,9 3 8,9 ± 0,8 Aller Aqua 2 1,9 ± 0,1 3 3,8 ± 0,5 Садковая технология КазНИИ ППП 2 3,9 ± 0,2 Aller Aqua 2 2,9 ± 0,7 Пелядь Озерно-товарное рыбоводство Контроль 1 24,3 ± 1,3 КазНИИ ППП 2 37,7 ± 2,1 Аминотрансферазы переносят аминогруппы от аминокислот к кетокислотам. Эти ферменты играют ключевую роль в обмене веществ, объединяя в единое целое белковый, углеводный, жировой обмен и цикл трикарбоновых кислот. Учитывая исключительную роль АсАТ и АлАТ в обмене основных метаболитов клетки, активность этих ферментов используют в качестве биохимического индикатора физиологического статуса и клинического индикатора стрессового состояния, вызванного заболеванием или интоксикацией у ряда организмов, в том числе и у рыб [15]. В табл. 4 представлены результаты анализа содержания общих белков и аминотрансферазной активности в микросомальной фракции молоди рыб, выращенных в различных условиях аквакультуры. Содержание белка в микросомальной фракции печени молоди форели снижалось на первых этапах эксперимента независимо от вида применяемого корма: при прямоточной бассейновой технологии с использованием корма, разработанного в КазНИИ ППП, количество общих белков снизилось с 8,78 ± 0,58 до 3,0 ± 0,26 мг/г сырой массы, т. е. почти в 3 раза. Установлено, что в микросомальной фракции печени форели активность АлАТ оказалась выше активности АсАТ во всех вариантах эксперимента. Например, в печени молоди форели при садковом выращивании и применении корма Aller Aqua активность АлАТ равнялась 2,81 ± 0,12 мкмоль/(с · мг) белка, в то время как активность АсАТ оказалась в 1,8 раза ниже и составляла 1,6 ± 0,04 мкмоль/(с · мг) белка. С увеличением сроков культивирования активность ферментов снижалась - так, у форели, выращенной на корме КазНИИ ППП, активность АсАТ уменьшилась с 0,66 ± 0,03 до 0,23 ± 0,01 мкмоль/(с · мг) белка. Применение садковых технологий приводило к повышению активности исследованных ферментов в печени форели по сравнению с бассейновым методом - при использовании кормов Aller Aqua активность АлАТ равнялась 2,81 ± 0,12, активность АсАТ - 1,6 ± 0,04 мкмоль/(с · мг) белка, и для данного вида эти значения оказались максимальными. У молоди пеляди исследованные показатели оказались выше при экспериментальном кормлении. Таблица 4 Содержание общих белков и аминотрансферазная активность в микросомальной фракции печени молоди рыб при различных условиях выращивания Вид рыб Место сбора Вид корма Отбор Содержание белка, мг/г сырой массы Активность, мкмоль/(с · мг) белка АлАТ АсАТ Форель Бассейновая технология, прямоток Контроль 1 8,78 ± 0,58 1,87 ± 0,16 0,66 ± 0,03 КазНИИ ППП 2 3,0 ± 0,26 1,15 ± 0,01 0,48 ± 0,02 3 3,77 ± 0,17 0,56 ± 0,01 0,23 ± 0,01 Aller Aqua 2 2,87 ± 0,03 1,76 ± 0,09 0,64 ± 0,05 3 3,1 ± 0,05 0,47 ± 0,05 0,41 ± 0,03 Садковая технология КазНИИ ППП 2 5,67 ± 0,28 2,21 ± 0,13 0,89 ± 0,01 Aller Aqua 2 3,28 ± 0,17 2,81 ± 0,12 1,6 ± 0,04 Пелядь Озерно-товарное рыбоводство Контроль 1 4,28 ± 0,41 0,29 ± 0,01 0,58 ± 0,01 КазНИИ ППП 2 5,21 ± 0,33 0,69 ± 0,01 0,7 ± 0,01 Аминотрансферазы не обладают органной специфичностью, однако определение их активности в крови используется для диагностики болезней печени и сердца, при которых происходит распад клеток. Например, при цитолизе гепатоцитов в несколько раз повышается активность не только АлАТ, но и АсАТ [15]. Влияние состава различных продукционных кормов и условий выращивания на химический состав мышечной ткани молоди форели и пеляди. Анализ химического состава спинных мышц включал в себя определение содержания сухого вещества и золы (табл. 5), содержания общих белков (без минерализации), общих липидов и гликогена (табл. 6). Таблица 5 Содержание сухих, зольных и органических веществ в спинных мышцах рыб при различных условиях выращивания Вид рыб Место сбора Вид корма Отбор Массовая доля веществ, % сухих зольных органических Форель Бассейновая технология, прямоток Контроль 1 20,2 1,22 19,0 КазНИИ ППП 2 22,3 1,31 21,0 3 23,4 1,59 21,8 Aller Aqua 2 24,1 1,14 23,0 3 25,2 1,34 23,9 Садковая технология КазНИИ ППП 2 20,6 1,2 19,4 Aller Aqua 2 21,9 1,24 20,7 Пелядь Озерно-товарное рыбоводство Контроль 1 22,5 1,39 21,1 КазНИИ ППП 2 22,2 1,55 20,7 Вода вместе с растворенными в ней органическими и минеральными веществами является средой, в которой осуществляются биохимические процессы, обеспечивающие жизнедеятельность организма. Значения массовой доли влаги и содержания органических веществ являются важными биохимическими показателями. Анализ полученных данных показал, что доля органических веществ в мышечной ткани молоди форели при выращивании по бассейновой технологии на корме Aller Aqua повысилась незначительно - до 23,9 %, а на кормах КазНИИ ППП - до 21,8 %; при садковом выращивании - до 20,7 и 19,4 % соответственно. Содержание органики в контрольных и опытных образцах пеляди оказалось приблизительно равным - 21,1 и 20,7 % соответственно. По пищевой ценности мясо рыбы стоит в ряду наиболее ценных продуктов питания. Белковый и аминокислотный состав белков рыбы имеет некоторые особенности по сравнению с составом белков мяса теплокровных животных и птиц: индивидуальные видовые отклонения в содержании белка; большое количество сложных белков (протеидов) и их концентрация в отдельных органах (например, в икре); большее содержание миофибриллярных белков, обладающих высокой гидратирующей способностью, чем объясняется малая потеря влаги при тепловой обработке; меньшее количество водорастворимых белков (саркоплазмы) и т. д. [16]. Таблица 6 Содержание общих белков, липидов, гликогенов в спинных мышцах рыб при различных условиях выращивания Вид рыб Место сбора Вид корма Отбор Содержание, г/100 г сырой массы белка липидов гликогена Форель Бассейновая технология, прямоток Контроль 1 14,0 ± 0,01 3,4 ± 0,01 0,48 ± 0,06 КазНИИ ППП 2 10,4 ± 0,02 4,4 ± 0,01 0,77 ± 0,12 3 23,3 ± 0,01 2,2 ± 0,01 0,47 ± 0,1 Aller aqua 2 12,1 ± 0,04 4,1 ± 0,01 0,53 ± 0,04 3 24,9 ± 0,02 3,2 ± 0,02 0,28 ± 0,01 Садковая технология КазНИИ ППП 2 22,4 ± 0,02 2,2 ± 0,03 0,53 ± 0,02 Aller Aqua 2 22,7 ± 0,01 3,1 ± 0,03 0,28 ± 0,03 Пелядь Озерно-товарное рыбоводство Контроль 1 18,9 ± 0,01 2,2 ± 0,05 0,10 ± 0,01 КазНИИ ППП 2 21,0 ± 0,01 1,9 ± 0,03 0,12 ± 0,02 Содержание общих белков в мышечных тканях молоди форели не зависело от вида использованного корма. Так, при бассейновой технологии с экспериментальным кормом КазНИИ ППП данное значение равнялось 23,3 ± 0,01, с кормом Aller Aqua - 24,9 ± 0,02 г/100 г сырой массы, а при использовании садковой технологии с теми же кормами - 22,4 ± 0,02 и 22,7 ± 0,01 г/100 г сырой массы, соответственно. При использовании экспериментального корма содержание общих белков в спинных мышцах повысилось до 21,0 ± 0,01 г/100 г сырой массы. Углеводы в мускулатуре рыбы представлены в основном гликогеном (животным крахмалом) и составляют более 1 %. При распаде гликогена (гидролизе или фосфоролизе) образуются глюкоза, пировиноградная и молочная кислоты. Содержание гликогена в печени форели не превысило 1 %. Значения массовой доли гликогена в мышцах молоди форели оказались приблизительно равными. Так, в разные сроки эксперимента при использовании в рационе корма Aller Aqua это значение составило 0,53 ± 0,04 г/100 г сырой массы, а при использовании экспериментального корма КазНИИ ППП - 0,77 ± 0,12 г/100 г сырой массы. Количество гликогена в спинных мышцах молоди пеляди не превышало 0,12 ± 0,02 г/100 г сырой массы. Для жира рыб характерным является присутствие непредельных жирных кислот с увеличенным числом двойных связей, которые составляют основу рыбьего жира (до 84 % от общего количества жирных кислот), что объясняет его жидкую консистенцию и легкую усвояемость. В то же время из-за высокой непредельности жирных кислот жир рыб легко окисляется с накоплением продуктов окисления (перекиси, гидроперекиси) и распада (альдегидов, кетонов, низкомолекулярных жирных кислот, спиртов и др.) [17]. Содержание общих липидов в мышечной ткани молоди форели с увеличением сроков культивирования снижалось независимо от вида использованного корма, например, при выращивании на корме КазНИИ ППП - с 0,77 до 0,47 ± 0,1 г/100 г сырой массы. Вид использованного корма не оказал достоверного влияния на содержание общих липидов в мышцах молоди пеляди. В контроле данное значение составило 0,10 ± 0,01, в опыте - 0,12 ± 0,02 г/100 г сырой массы. Заключение Сравнительный анализ биохимических показателей молоди форели и пеляди в условиях бассейнового и садкового выращивания позволил оценить степень изменений физиологического состояния последних при выращивании на кормах различных рецептур. Установлено, что в микросомальной фракции печени форели активность АлАТ оказалась выше активности АсАТ во всех вариантах эксперимента, что не соответствует норме. У пеляди аминотрансферазная активность оказалась выше при экспериментальном кормлении. С увеличением сроков культивирования наблюдалось снижение содержания МДА в печени форели. У пеляди использование экспериментальных кормов приводило к повышению содержания МДА в печени. Выявлено, что форель имеет одинаковые биохимические показатели мышечной массы при использовании комбикорма, разработанного в КазНИИ ППП, и комбикорма марки Aller Aqua. Вид использованных кормов не оказал достоверного влияния на содержание общих белков, липидов и гликогена в мышцах молоди пеляди.