ВЛИЯНИЕ ИОНОВ СВИНЦА НА АКТИВНОСТЬ ГЛИКОЗИДАЗ У РЫБ-БЕНТОФАГОВ ИЗ УЧАСТКОВ РЫБИНСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА С РАЗНОЙ АНТРОПОГЕННОЙ НАГРУЗКОЙ
Аннотация и ключевые слова
Аннотация (русский):
Изучено in vitro влияние ионов свинца (Pb2+) в концентрации 0,01–25 мг/л на активность гликозидаз (мальтаза, амилолитическая активность) в слизистой оболочке кишечника взрослых рыб-бентофагов (лещ Abramis brama (L.), масса 1200–1230 г и плотва Rutilus rutilus (L.), масса 300–320 г), обитающих в районах Рыбинского водохранилища с разной антропогенной нагрузкой. Амилолитическую активность определяли методом Нельсона, активность мальтазы – глюкозооксидазным методом. Ионы свинца Pb2+ вызывают разнонаправленные изменения активности гликозидаз, при этом ферменты леща более чувствительны к действию ионов свинца по сравнению c ферментами плотвы. Ферменты рыб, отловленных в более чистом Волжском плесе, наиболее чувствительны к негативному действию ионов свинца по сравнению с ферментами рыб из более загрязненного Шекснинского плеса.

Ключевые слова:
рыбы, лещ, плотва, пищеварительные гликозидазы, амилолитическая активность, мальтаза, тяжелые металлы, свинец
Текст
Текст произведения (PDF): Читать Скачать

Введение Свинец относится к группе тяжелых металлов, входящих в состав основных загрязнителей окружающей среды. Наряду с кадмием он не играет существенной роли в процессах жизнедеятельности, но обладает высокой токсичностью при относительно низких концентрациях. Поступая в организм с водой и пищей, он способен аккумулироваться в организме гидробионтов в концентрациях, превышающих его содержание в окружающей среде [1–3]. Для воды водоемов рыбохозяйственного назначения ПДК свинца составляет 6 мкг/л, однако в районах техногенного загрязнения его содержание в мышцах и печени пресноводных рыб достигает 2–15 мг/кг [1]. Высокие значения концентрации свинца отмечены в донных отложениях водоемов и в кормовых объектах рыб-бентофагов [1, 3]. Попадая в организм рыб, тяжелые металлы могут оказывать прямое и опосредованное влияние на активность ферментов пищеварительного тракта. Поскольку значительное количество тяжелых металлов накапливается в грунтах, бентосоядные рыбы являются наиболее удобным объектом для изучения действия тяжелых металлов на процессы пищеварения. Цель исследований – изучить влияние ионов свинца in vitro на активность гликозидаз слизистой оболочки кишечника рыб-бентофагов, обитающих в районах Рыбинского водохранилища с разной антропогенной нагрузкой. Материалы и методы исследования Объекты исследования – лещ Abramis brama (L.) и плотва Rutilus rutilus (L.) – массовые виды рыб Рыбинского водохранилища, имеющие большое промысловое значение. Рыбы отловлены ставными сетями в марте – апреле 2011–2012 гг. на двух участках Рыбинского водохранилища (58°30' с. ш., 38°20' в. д.), отличающихся по степени антропогенной нагрузки: в Шекснинском плесе (ст. Любец), в который поступают бытовые и сточные воды г. Череповец, и в Волжском плесе (ст. Коприно), наиболее удаленном от локального источника загрязнения. После поимки рыб обездвиживали, кишечники извлекали и хранили при температуре –18 ºС не более 1 месяца. Масса леща из Волжского плёса составляла 1200 ± 130 г, длина тела – 40,0 ± 1,3 см, из Шекснинского - 1230 ± 64 г и 41,6 ± 0,6 см соответственно. Масса плотвы из Волжского плёса составляла 302 ± 50 г, длина тела – 25,5 ± 1,5 см, из Шекснинского плёса - 317,6 ± 150 г и 25,6 ± 3,5 см. Активность гликозидаз (мальтаза и амилолитическая активность) определяли в гомогенатах слизистой оболочки медиального отдела кишечника. Амилолитическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал (a-амилаза КФ 3.2.1.1, глюкоамилаза КФ 3.2.1.3 и мальтаза КФ 3.2.1.20) оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [4]. Активность мальтазы определяли глюкозооксидазным методом с помощью набора для клинической биохимии «Фотоглюкоза» (ООО «Импакт», Россия). Инкубацию гомогенатов и субстратов проводили при температуре 20 °С и рН 7,4 в течение 20−60 мин. При оценке влияния ионов свинца гомогенаты предварительно инкубировали в присутствии азотнокислой соли свинца Pb(NO3)2 в течение 1 часа. Значения концентрации ионов Pb2+, рассчитанные по общему содержанию металла в соли, составляли 0 (контроль); 0,01; 0,1; 1; 5; 10 и 25 мг/л. Выбор диапазона концентраций обусловлен значениями ПДК этих металлов и их содержанием в тканях рыб и их кормовых объектов [1–3]. Ферментативную активность выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 минуту инкубации ферментативно-активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани, мкмоль/(г × мин). Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M ± m). Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Уровень амилолитической активности в кишечнике леща и плотвы из Шекснинского плеса на 15-30 % ниже, чем у рыб из более чистого Волжского плеса (табл.). В то же время активность мальтазы у рыб из разных плесов не различалась. Ионы свинца достоверно изменяют активность исследованных гликозидаз во всех вариантах опыта (р < 0,013), исключая активность мальтазы в кишечнике плотвы Шекснинского плеса (р = 0,2110). С увеличением концентрации ионов свинца амилолитическая активность у леща из обоих плесов достоверно снижается. У рыб из Волжского плеса снижение ферментативной активности на 10-27 % отмечено при концентрации 0,01-25 мг/л, из Шекснинского на 10-22 % лишь при концентрации 5-25 мг/л. При этом прямой зависимости тормозящего эффекта от концентрации металла не выявлено. У плотвы из более чистого плеса амилолитическая активность снижается на 11-12 % лишь при концентрации ионов свинца 5 и 10 мг/л, из более загрязненного Шекснинского плеса повышается на 11-22 % практически во всем диапазоне концентраций. Активность мальтазы у леща из Волжского плеса снижается на 16-30 % при концентрации ионов металла 1-25 мг/л, из Шекснинском плеса, напротив, возрастает на 9-16 % в диапазоне концентраций ионов свинца 0,01-10 мг/л. Однако четкого концентрационно-зависимого эффекта не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии прямого действия металла на молекулу фермента. Активность мальтазы в кишечнике плотвы из Волжского плеса достоверно повышалась на 16 % лишь при концентрации ионов свинца 10 мг/л, у леща Шекснинского плеса достоверных эффектов не обнаружено. В целом свинец оказывает больший тормозящий эффект на амилолитическую активность, что, по всей вероятности, связано с большей чувствительностью панкреатической a-амилазы, входящей в состав ферментов, гидролизующих крахмал, по сравнению с мембранным ферментом мальтазой. Сопоставление активности одноименных ферментов у рыб, выловленных в Волжском и Шекснинском плесах, выявило существенные различия. Так, у леща из более чистого плеса тормозящий эффект выявлен в более широком диапазоне концентраций ионов свинца по сравнению с загрязненным плесом. У плотвы ингибирующий эффект свинца на амилолитическую активность отмечен лишь у рыб Волжского плеса. Активность мальтазы у леща из Волжского плеса с ростом концентрации металла снижается, в то время как у леща из Шекснинского плеса повышается. Различия в динамике активности ферментов в присутствии свинца у рыб из двух плесов могут быть связаны с разной антропогенной нагрузкой. Действительно, во всех компонентах экосистемы Шекснинского плеса на протяжении нескольких десятков лет содержится значительное количество тяжелых металлов и органических загрязнителей [1, 5]. Вполне вероятно, что в условиях хронического загрязнения у рыб в лучше развиты системы детоксикации и выведения из организма тяжелых металлов. У рыб из более чистого Волжского плеса в присутствии свинца в большинстве случаев происходит торможение активности гликозидаз, не приспособленных к повышенному содержанию металла в среде. Эти результаты хорошо согласуются с данными по активности ферментов антиоксидантной системы печени и показателей перекисного окисления липидов, которые свидетельствуют о неблагополучном состоянии леща Шекснинского плеса Рыбинского водохранилища [6]. Активность гликозидаз в слизистой оболочке кишечника леща и плотвы из относительно чистого (Волжский плес) и загрязненного (Шекснинский плес) участков Рыбинского водохранилища, мкмоль/(г × мин)* Концентрация ионов Pb, мг/л Лещ Плотва Волжский плес Шекснинский плес Волжский плес Шекснинский плес Амилолитическая активность Контроль (0) 1,55 ± 0,01а 1,32 ± 0,01а 2,75 ± 0,12а 1,92 ± 0,05а 0,01 1,40 ± 0,02б,в 1,23 ± 0,03а,б 3,47 ± 0,06б 2,13 ± 0,06б 0,1 1,40 ± 0,02б,в 1,39 ± 0,04а 2,48 ± 0,03а,в 2,16 ± 0,05б 1 1,35 ± 0,02в 1,37 ± 0,02а,б 2,80 ± 0,04а 2,35 ± 0,03в 5 1,44 ± 0,02б 1,03 ± 0,01в 2,43 ± 0,05в 2,32 ± 0,05в 10 1,27 ± 0,01г 1,07 ± 0,02в 2,45 ± 0,03в 1,95 ± 0,03а 25 1,13 ± 0,02д 1,19 ± 0,01б 2,72 ± 0,07а 2,24 ± 0,05б,в Активность мальтазы Контроль (0) 3,26 ± 0,09а 3,16 ± 0,04а 6,11 ± 0,20а 6,22 ± 0,08а, 0,01 3,22 ± 0,13а 3,67 ± 0,12б 6,13 ± 0,22 а 6,02 ± 0,28а 0,1 3,23 ± 0,07а 3,50 ± 0,05б 6,74 ± 0,12а,б 6,80 ± 0,37а 1 2,75 ± 0,10б 3,62 ± 0,14б 5,95 ± 0,24а 6,51 ± 0,26а 5 2,29 ± 0,03в 3,58 ± 0,09б 6,31 ± 0,26а,б 6,72 ± 0,28а 10 2,28 ± 0,02в 3,45 ± 0,07б 7,08 ± 0,15б 6,95 ± 0,24а 25 2,31 ± 0,03в 3,41 ± 0,10а,б 6,37 ± 0,13а,б 6,43 ± 0,19а * Разные надстрочные индексы указывают на статистически достоверные различия между показателями в каждом столбце (ANOVA, LSD-тест), p < 0,05. Гликозидазы плотвы более устойчивы к действию свинца по сравнению с гликозидазами леща, что может быть связано с большим количеством тяжелых металлов в ее естественной пище. Действительно, в питании пойменно-придонной экологической формы плотвы преобладает дрейссена, в тканях которой зарегистрирован высокий уровень содержания тяжелых металлов, в том числе и свинца [3]. Механизм токсического действия свинца на пищеварительные ферменты рыб до сих пор не изучен и, по всей вероятности, неспецифичен. Поскольку существует несколько изоформ α-амилазы, глюкоамилазы и мальтазы, нельзя исключить молекулярную разнокачественность ферментов, функционирующих в кишечнике рыб из относительно чистого и загрязненного районов. Кроме того, выявленные различия могут быть обусловлены изменением состава кормовой базы, спектра питания и биохимического состава пищи у рыб, обитающих в загрязненном районе, а также разным влиянием токсических веществ на чувствительность панкреатических и собственно кишечных гликозидаз к действию ионов свинца. Заключение Полученные результаты свидетельствуют о более низком уровне амилолитической активности и активности мальтазы в слизистой оболочке кишечника леща и плотвы, выловленных в загрязненном Шекснинском плесе Рыбинского водохранилища, по сравнению с рыбами, выловленными в относительно чистом Волжским плесе. В присутствии ионов свинца в концентрации 0,01–25 мг/л у исследованных видов рыб выявлены разнонаправленные изменения активности гликозидаз, при этом ферменты леща более чувствительны к действию ионов свинца по сравнению c ферментами плотвы. Гликозидазы рыб, отловленных в более чистом плесе, наиболее чувствительны к негативному действию ионов свинца по сравнению с гликозидазами рыб более загрязненного плеса.
Список литературы

1. Перевозников М. А. Тяжелые металлы в пресноводных экосистемах / М. А. Перевозников, Е. А. Богданова. СПб.: Гос. науч.-исслед. ин-т озер. и реч. хоз-ва, 1999. 228 с.

2. Askary Sary A. Lead bioaccumulation and toxicity in tissue of economically fish species from river and marine water / A. Askary Sary, M. Mohammadi // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2012. Vol. 89, N 1. P. 82–85.

3. Светашова Е. С. К вопросу накопления тяжелых металлов в водных экосистемах / Е. С. Светашова // Экологические проблемы пресноводных рыбохозяйственных водоемов России: Всерос. науч. конф. с междунар. участием. Казань, 2011. С. 371-375.

4. Уголев А. М. Определение активности инвертазы и других дисахаридаз / А. М. Уголев, Н. Н. Иезуитова // Исследование пищеварительного аппарата у человека. Л.: Наука, 1969. С. 192-196.

5. Флеров Б. А. Комплексная оценка состояния донных отложений Рыбинского водохранилища / Б. А. Флеров, И. И. Томилина, Л. Кливленд, А. И. Баканов, М. В. Гапеева. // Биология внутр. вод. 2000. № 2. С. 148–155.

6. Morozov A. A. Functional State of the Liver Antioxidant System of the Bream Abramis brama (L.) from Rybinsk Reservoir Regions with Different Anthropogenic Loads / A. A. Morozov, G. M. Chuiko, E. S. Brodskii // Inland Water Biology. 2012. Vol. 5, N 1. P. 147–152.