Текст (PDF):
Читать
Скачать
Введение Криоконсервация мужских половых клеток в жидком азоте считается одним из перспективных способов сохранения генетического разнообразия редких и исчезающих видов. Вместе с тем применение существующих методов замораживания и последующего размораживания спермы сопровождается снижением ее активности, т. е. потерей способности значительной доли сперматозоидов к оплодотворению яйцеклетки [1–4]. При изучении размороженной спермы на свето- и электронно-микроскопическом уровнях отмечаются агглютинация спермиев, утрата ими структур, обусловливающих двигательную активность, и другие морфофункциональные изменения [5, 6]. Гибель или инактивация определенной доли спермиев позволяют предполагать существование отбора в пользу определенных изоферментов, поскольку происходит биохимическая адаптация к изменяющимся условиям среды [7]. Существование селективности генотипов при замораживании/размораживании подтверждается и косвенными данными ряда исследователей, использовавших криоконсервированную сперму в рыбоводстве. В частности, отмечено смещение соотношения полов в пользу самок у «криопотомства» сибирского осетра ленской популяции, выращенного на Конаковском заводе товарного осетроводства, и его превосходство по темпу роста над молодью, полученной традиционным способом [8, 9]. Проблема селективности генотипов долгое время недооценивалась в рыбоводстве. Вместе с тем резкое сокращение запасов осетровых и изменение биологических показателей рыб в течение последних 20 лет, которое нельзя объяснить только резким увеличением браконьерства, подняло вопрос о генетической полноценности выпускаемой заводской молоди [10–13]. Изучение влияния рыбоводства показало, в частности, что выпуск «заводской» молоди осетровых в естественные водоемы приводит к увеличению доли гетерозигот, тогда как отклонение этого показателя от исторического оптимума вызывает сокращение численности популяций и их постепенную деградацию в последующих поколениях [12–16]. В связи с возможным влиянием криоконсервации мужских половых клеток на генетическую гетерогенность получаемого потомства нами были проведены прямые опыты на русском осетре с использованием метода определения в тканях личинок изменчивости изозимов ферментов малатдегидрогеназы и эстеразы, хорошо зарекомендовавших себя как генетико-биохимические маркеры [17]. Ранее специальные эксперименты в этом направлении не проводились. Материалы и методы исследований В производственных условиях Александровского осетрового рыбоводного завода проведены 2 опыта по изучению влияния криоконсервированной спермы на генетические характеристики потомства русского осетра Acipenser güldenstädtii Brandt. Работа состояла из нескольких этапов. На первом этапе определяли качество спермы до замораживания (нативная сперма) и выбирали образцы для опыта [18]. На втором этапе проведен процесс замораживания/размораживания образцов спермы, с одновременным сохранением образцов нативной спермы в течение 24 часов в гипотермических условиях [19]. Процессы криоконсервации и дефростации спермы проведены сотрудником Центральной лаборатории по воспроизводству рыбных запасов Г. Е. Луневым по оригинальной методике с использованием метилового спирта вместо традиционного диметилсульфоксида (ДМСО) [20], за что авторы настоящей работы выражают ему свою искреннюю признательность. На третьем этапе было проведено оплодотворение одинаковых порций икры от двух самок нативной и дефростированной спермой. От каждой из самок одну порцию икры оплодотворили нативной спермой от трех самцов, другую – замороженно/размороженной спермой этих же самцов. Для оплодотворения каждой порции икры было использовано по 3 мл размороженной смеси сперма + протектор (1 : 1) от каждого самца, т. е. расход спермы (4,5 мл неразбавленной протектором спермы на 20–25 г) был в несколько раз выше, чем при оплодотворении икры нативной спермой в производственных условиях (30 мл на 1 кг). Четвертый этап включал процессы обесклеивания икры, инкубации в аппарате «Осетр» с обработкой противогрибковыми препаратами, отбором, удалением и учетом пораженной сапролегнией икры и поштучным пересчетом выклевывающихся личинок (стадия 36). Определение процента оплодотворения (% оплодотворения) проводили на стадии четырех бластомеров (1–2 стадия развития), процент нормального развития эмбрионов (% НРЭ) определяли на стадии малой желточной пробки (16 стадия) [21]. На этом этапе использовались стандартные производственные методы, рассчитанные на работу с большими объемами икры. Температура воды во время инкубации – 13–14 °С. Период эмбрионального развития составил около 11 суток. На пятом этапе личинок выдерживали в жестко закрепленных ящиках аппарата «Осетр» до стадии 44, предшествующей началу экзогенного питания. Температура воды в период выдерживания личинок постепенно возрастала от 15 до 17–18 °С в конце эксперимента. На 44-й стадии количество эндогенного желтка (имеющего материнский генотип) сокращалось до минимума и начинали проявляться особенности индивидуального генотипа. В конце эксперимента личинок пересчитали поштучно и заморозили для генетического анализа. Всего в опытах участвовали 2 самки и 6 самцов, от которых получено около 4 тыс. личинок и подвергнуто генетическому анализу 576 шт. Генетико-биохимические исследования проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле [22]. Этот метод позволяет охарактеризовать как индивидуальные генотипы рыб, так и уровень гетерогенности и аллельного разнообразия изоферментов исследуемой выборки в целом [23, 24]. О важной роли изоферментов в регуляции метаболических процессов свидетельствует изменение их спектра под влиянием различных воздействий и физиологических состояний (охлаждение, гипоксия и др.). Как отмечается в ряде работ, многие протеолитические и эстеролитические ферменты могут адекватно демонстрировать адаптационные возможности организма [15, 17, 25–28]. Поскольку изоферменты различаются по своим свойствам (оптимуму рН, активации ионами, сродству к субстратам, ингибиторам, активаторам, кофакторам), то характер их электрофоретического спектра отражает регуляторные механизмы, контролирующие метаболизм [7, 17, 25]. В качестве генетических маркеров использовали 2 полиморфные ферментные системы: малатдегидрогеназу (МДГ) и эстеразу (Эст), у которых уже на личиночной стадии фенотипически проявляются индивидуальные, а не только материнские спектры аллозимов. Генетическую гетерогенность выборок оценивали по частоте встречаемости аллелей, уровню гетерозиготности – наблюдаемой Ноb и ожидаемой Не, критерию χ2 [29]. Данные по частотам генов были проанализированы с помощью теста χ2 на гетерогенность Д. В. Ниля и У. Д. Шелла [30], часто применяемого в популяционной генетике [23, 24, 29]. Результаты исследований и их обсуждение Показатели активности спермы, использованной в опыте 1 (самцы 1–3) и опыте 2 (самцы 4–6) до и после криоконсервации, свидетельствуют о высоком качестве нативной спермы и ее существенном ухудшении после замораживания/размораживания (табл. 1). Таблица 1 Характеристика самцов и полученной от них спермы (до и после криоконсервации) № самца Масса, кг Визуальная оценка спермы, балл Концентрация спермиев, млн/мм3 Время сохранения подвижности нативной спермы, мин Доля спермиев, совершающих поступательное движение, % Нативная Размороженная 1 9,6 3 0,74 ± 0,26 12 90 20 2 8,5 4 1,07 ± 0,11 6 95 30 3 7,5 3–4 0,74 ± 1,07 10 90 25 4 10,2 3–4 0,91 ± 1,18 5 95 25 5 8,5 4 1,07 ± 0,11 6 95 30 6 7,4 3–4 0,6 ± 1,00 9 90 25 Однако использование криоконсервированной спермы слабо отразилось на показателях оплодотворения икры (снижение на 5–7 %), поскольку при оплодотворении низкую концентрацию и подвижность криоспермиев компенсировали увеличением их численности (количеством спермадоз) (табл. 2). Наблюдения за эмбриональным и постэмбриональным развитием опытных и контрольных вариантов показали, что использование криоконсервированной спермы приводит к увеличению смертности, прежде всего на самых ранних этапах развития. У 49 % «криоэмбрионов» в опыте 1 и 29 % в опыте 2 развитие прекратилось до 16-й стадии, поэтому % НРЭ в обоих опытных вариантах был в 1,5–2 раза ниже, чем в контроле, с последующим снижением показателей вылупления личинок (табл. 2). Следовательно, уже на стадиях дробления и гаструляции начинается нарушение развития и идет отбор жизнеспособных «криоэмбрионов». Таблица 2 Результаты наблюдений за развитием эмбрионов и личинок русского осетра, полученных из икры, оплодотворенной криоконсервированной или нативной спермой № варианта Вариант % оплодотво- рения % НРЭ Выход личинок, % Выдерживание личинок, % Выход личинок 44-стадии от икры, % Норма Уроды 36-я стадия 44-я стадия 1 Контроль 1 99 98 80,8 6,6 100 98,4 72,8 Опыт 1 92 43 38,6 3,6 100 79,2 30,6 2 Контроль 2 100 99 89,6 1,3 100 97,7 71,2 Опыт 2 95 66 44,8 0,46 100 97,1 43,5 На постэмбриональных стадиях развития только в опыте 1 проявилась более высокая смертность у личинок, полученных с использованием криоконсервированной спермы, – на 20 %. В варианте 2 смертность личинок в опыте и контроле практически не различалась. Таким образом, в вариантах с использованием криоконсервированной спермы выживаемость личинок до достижения 44-й стадии была почти в 2 раза ниже, чем в соответствующих контрольных вариантах, при этом основной отбор эмбрионов происходит до 16-й стадии развития. Это свидетельствует о том, что уже на первых этапах развития в «криопотомстве» происходит определенный отбор на выживаемость. Исследование генетической гетерогенности выживших личинок показало, что аллозимы исследованных ферментных систем дифференцированно реагируют на криовмешательство в процесс размножения (табл. 3, 4). По частотам встречаемости аллелей локуса МДГ в проведенных опытах и контроле не выявлено достоверных различий. Однако в опыте 1 наблюдается увеличение гетерозиготности на 31 % и изменение соотношения частот генотипов гомо- и гетерозиготных генотипов АА и АВ в сторону увеличения гетерозигот почти в 2 раза. В опыте 2 такого явления не наблюдается, видимо потому, что у личинок второго варианта в контроле частота встречаемости гетерозиготного генотипа АВ почти в 3 раза выше, чем в опыте 1 и отмечена более высокая гетерозиготность. Поэтому изменение соотношения частот аллелей в локусе МДГ у личинок в опыте 2 было менее выражено в условиях оплодотворения криоконсервированной спермой (табл. 3). В обоих вариантах отмечается тенденция к увеличению количества гетерозигот МДГ. При этом значения χ2 в опытах и контроле выше допустимых. Следовательно, не выполняется закон Харди – Вайнберга о равновесном состоянии популяций (выборок), и они находятся под влиянием отбора (табл. 3). Таблица 3 Частота встречаемости генотипов и аллелей МДГ у личинок русского осетра в опыте и контроле Генотип АА АВ АС ВВ ВС СС N рА рВ рС Но Не χ2 D* Опыт 1 32 50 20 45 0 0 147 0,456 ± 0,03 0,476 ± 0,03 0,068 ± 0,02 0,476 ± 0,04 0,561 ± 0,01 30,3 –0,151 ± 0,07 Контроль 1 48 27 22 53 0 0 150 0,486 ± 0,03 0,443 ± 0,03 0,073 ± 0,02 0,327 ± 0,04 0,564 ± 0,01 67,9 –0,42 ± 0,05 Опыт 2 8 85 4 40 0 0 137 0,383 ± 0,03 0,602 ± 0,03 0,015 ± 0,01 0,649 ± 0,04 0,490 ± 0,02 23,1 +0,32 ± 0,06 Контроль 2 18 82 6 36 0 0 142 0,437 ± 0,03 0,542 ± 0,03 0,021 ± 0,01 0,620 ± 0,04 0,515 ± 0,01 14,8 +0,20 ± 0,07 * D – отклонение от ожидаемой гетерозиготности. По локусу Эст в первом варианте эксперимента по всем генетическими показателям опыта и контроля не обнаружено различий, однако в опыте 1 полностью отсутствует аллель е. Во втором варианте, согласно тесту на гетерогенность, наблюдаются достоверные различия по частоте встречаемости аллеля а (8,2 при р < 0,01) и аллеля е (8,34 при р < 0,01), и доля гетерозигот в опыте на 30 % превышает таковую в контроле. Все выборки, согласно критерию χ2, находятся в неравновесном состоянии и, следовательно, подвергаются влиянию отбора (табл. 4). Таблица 4 Частота встречаемости генотипов и аллелей Эст у личинок русского осетра в опыте и контроле Генотип а ае е Количество, шт. ра ре Но Не χ2 D Опыт 1 61 86 0 147 0,707 ± 0,26 0,292 ± 0,02 0,585 ± 0,04 0,413 ± 0,02 25,1 +0,413 ± 0,06 Контроль 1 70 84 7 161 0,695 ± 0,03 0,305 ± 0,03 0,524 ± 0,04 0,423 ± 0,02 8,7 +0,232 ± 0,07 Опыт 2 32 130 0 162 0,598 ± 0,03 0,402 ± 0,01 0,802 ± 0,03 0,480 ± 0,01 72,7 +0,67 ± 0,03 Контроль 2 57 74 1 132 0,713 ± 0,03 0,287 ± 0,03 0,560 ± 0,04 0,410 ± 0,03 17,9 +0,367 ± 0,07 В данном локусе разница генетических параметров между контрольными выборками несущественна. Однако во втором варианте опыта наблюдается явный отбор в пользу гетерозигот ае, что подчеркивает общую тенденцию к увеличению гетерозиготности. В целом опыты по оплодотворению икры криоконсервированной спермой показали в опытных вариантах достоверное снижение доли нормально развивающихся эмбрионов – с 98–99 % в контроле до 43 и 66 % в опыте, уменьшение выживаемости личинок «от икры» до достижения 44-й стадии в первом опыте на 58 % по сравнению с контролем, во втором – на 39 %, а также увеличение доли некоторых гетерозигот и гетерозиготности по исследованным локусам. Таким образом, процесс замораживания/размораживания является для спермиев существенным стрессовым фактором, который обусловливает селективную смертность потомства и избирательное влияние криоконсервации на генофонд. В условиях применения криотехнологий отбор проходит на следующих этапах: подготовки к замораживанию (влияние криопротекторов); замораживания (важнейший фактор – режим понижения температуры); хранения; размораживания; активизации спермы водой; оплодотворения икры; в периоды эмбрионального и постэмбрионального развития. Полученные данные показали, что только в процессе замораживания/размораживания спермы из процесса размножения исключается 75–80 % мужских гамет (см. табл. 1). На этапе развития икры погибает около 40–60 % эмбрионов, следовательно, остается 10–15 % от начального количества криоспермиев (табл. 2). На этапе развития личинок отход сравнительно небольшой (от 3 до 20 %), но в конечном итоге от исходных «криоспермиев» остается чуть больше 10 %, которые и внесут свой вклад в генофонд потомства (см. табл. 2). В это же время вклад нативных спермиев составляет не менее 70 %. Следовательно, даже в условиях нашего опыта с относительно высокими показателями выживаемости эмбрионов и личинок, подтвердилось предположение о селективном выживании как «криоспермиев», так и «криопотомства». Это обстоятельство подтверждает известный факт высокого эмбрионального отбора «криозигот» и наличие более низкого выхода личинок при оплодотворении икры криоконсервированной спермой [2–5, 8, 9]. При этом естественно предположить, что использование различных криопротекторов и технологий замораживания/размораживания может по-разному влиять на генофонд потомства. Исследование генетических показателей опытного и контрольного потомства показало преимущество в данных условиях гетерозиготных генотипов по исследованным локусам. Следует обратить внимание также на то, что менее распространенный гомозиготный генотип е по локусу Эст у «криоличинок» обнаружен не был, поэтому использование криотехнологий в процессе размножения осетровых рыб можно рассматривать как жесткое воздействие, в условиях которого происходит увеличение доли гетерозигот в потомстве. Однако сравнение результатов двух вариантов опыта, показавших разную интенсивность смещения соотношения частот генотипов по МДГ и Эст, позволяет предположить, что направление и интенсивность отбора могут быть связаны с особенностями генотипов родителей, другими изоферментами, а также комплементарностью, полимерным воздействием и другими взаимодействиями генов. Отсутствие генетического равновесия во всех выборках и смещение равновесия D в основном в пользу гетерозигот свидетельствуют о наличии как стрессового отбора в опытах, так и естественного отбора в контроле. Избирательная эмбриональная смертность (отбор) менее приспособленных генотипов в процессе онтогенетического развития, выявленная в контрольных выборках, присуща всему живому – человеку, животным, насекомым, растениям [15, 23, 26, 31], поэтому и в данном эксперименте мы наблюдаем, что в колеблющихся или стрессовых условиях среды любой отбор создает оптимальное для нее соотношение генотипов [10, 15, 26, 31]. Полученные данные, несмотря на предварительный характер экспериментов, свидетельствуют об изменении генетической структуры криопотомства в сторону увеличения доли гетерозигот как более устойчивых к вредным воздействиям. Подобная селективность (в сторону преобладания гетерозигот) присуща рыбоводному процессу и является весьма нежелательным фактором, поскольку увеличение гетерозиготности по сравнению с исторически сложившимся оптимумом, характерным для нетронутых популяций, ведет к нарушению популяционной структуры и снижению численности вида. Более гетерозиготные особи, как правило, мельче, менее плодовиты, имеют более короткий жизненный цикл, отличаются повышенной скоростью роста в начале жизненного цикла и, таким образом, более приспособлены к неоптимальным условиям среды [12–16]. Есть также данные, что гетерозиготы по локусу эстераз различных органов являются менее приспособленными по сравнению с гомозиготами [27]. Следовательно, молодь, полученная с использованием криоконсервированной спермы, оказывается менее соответствующей исторически сложившемуся генетическому оптимуму даже по сравнению с обычной заводской молодью. Заключение В настоящее время связь генетической структуры популяции с ее приспособленностью и численностью не вызывает сомнения, поэтому увеличение или элиминация каких-то определенных генотипов в процессе замораживания/размораживания является весьма принципиальным моментом, если криопотомство будет выпускаться в природные водоемы. В связи с этим, на наш взгляд, применение криоконсервированной спермы при искусственном воспроизводстве осетровых целесообразно ограничить товарными хозяйствами. Для снижения селективной смертности генетического материала в процессе криоконсервации необходимо продолжить экспериментальную работу по определению наиболее щадящих режимов замораживания/оттаивания осетровой спермы и изучение влияния использования такой спермы на генофонд потомства.
