INFLUENCE OF MILT CRYOCONSERVATION ON SURVIVAL AND GENETIC POLYMORPHISM OF LARVAE OF RUSSIAN STURGEON
Abstract and keywords
Abstract (English):
The influence of milt cryoconservation on genetic indices of progeny of Russian sturgeon was investigated. There were conducted two experiments on fecundation of hardroe with the use of native and frozen-thawed milt from the same breeders, and the enzymes of malate dehydrogenase and esterase in tissues of larvae at the stage of beginning of active feeding by methods of polyacrilamyde gel electrophoresis are studied. The use of сryoconserved milt led to a decreased number of larvae at the end of the experiment, mainly because of elevated mortality at early embryonal stages. Selective embryonal mortality induced increasing of heterozygosity of brood, changing the rates of genotypes and segregation of rare allele е at esterase locus. This selectivity had the same direction as negative selective impact of artificial breeding on genetic parameters of populations of Volga sturgeon.

Keywords:
cryoconservation, genetic-biochemical markers, sperm, embryos, larvae, development, mortality
Text
Введение Криоконсервация мужских половых клеток в жидком азоте считается одним из перспективных способов сохранения генетического разнообразия редких и исчезающих видов. Вместе с тем применение существующих методов замораживания и последующего размораживания спермы сопровождается снижением ее активности, т. е. потерей способности значительной доли сперматозоидов к оплодотворению яйцеклетки [1–4]. При изучении размороженной спермы на свето- и электронно-микроскопическом уровнях отмечаются агглютинация спермиев, утрата ими структур, обусловливающих двигательную активность, и другие морфофункциональные изменения [5, 6]. Гибель или инактивация определенной доли спермиев позволяют предполагать существование отбора в пользу определенных изоферментов, поскольку происходит биохимическая адаптация к изменяющимся условиям среды [7]. Существование селективности генотипов при замораживании/размораживании подтверждается и косвенными данными ряда исследователей, использовавших криоконсервированную сперму в рыбоводстве. В частности, отмечено смещение соотношения полов в пользу самок у «криопотомства» сибирского осетра ленской популяции, выращенного на Конаковском заводе товарного осетроводства, и его превосходство по темпу роста над молодью, полученной традиционным способом [8, 9]. Проблема селективности генотипов долгое время недооценивалась в рыбоводстве. Вместе с тем резкое сокращение запасов осетровых и изменение биологических показателей рыб в течение последних 20 лет, которое нельзя объяснить только резким увеличением браконьерства, подняло вопрос о генетической полноценности выпускаемой заводской молоди [10–13]. Изучение влияния рыбоводства показало, в частности, что выпуск «заводской» молоди осетровых в естественные водоемы приводит к увеличению доли гетерозигот, тогда как отклонение этого показателя от исторического оптимума вызывает сокращение численности популяций и их постепенную деградацию в последующих поколениях [12–16]. В связи с возможным влиянием криоконсервации мужских половых клеток на генетическую гетерогенность получаемого потомства нами были проведены прямые опыты на русском осетре с использованием метода определения в тканях личинок изменчивости изозимов ферментов малатдегидрогеназы и эстеразы, хорошо зарекомендовавших себя как генетико-биохимические маркеры [17]. Ранее специальные эксперименты в этом направлении не проводились. Материалы и методы исследований В производственных условиях Александровского осетрового рыбоводного завода проведены 2 опыта по изучению влияния криоконсервированной спермы на генетические характеристики потомства русского осетра Acipenser güldenstädtii Brandt. Работа состояла из нескольких этапов. На первом этапе определяли качество спермы до замораживания (нативная сперма) и выбирали образцы для опыта [18]. На втором этапе проведен процесс замораживания/размораживания образцов спермы, с одновременным сохранением образцов нативной спермы в течение 24 часов в гипотермических условиях [19]. Процессы криоконсервации и дефростации спермы проведены сотрудником Центральной лаборатории по воспроизводству рыбных запасов Г. Е. Луневым по оригинальной методике с использованием метилового спирта вместо традиционного диметилсульфоксида (ДМСО) [20], за что авторы настоящей работы выражают ему свою искреннюю признательность. На третьем этапе было проведено оплодотворение одинаковых порций икры от двух самок нативной и дефростированной спермой. От каждой из самок одну порцию икры оплодотворили нативной спермой от трех самцов, другую – замороженно/размороженной спермой этих же самцов. Для оплодотворения каждой порции икры было использовано по 3 мл размороженной смеси сперма + протектор (1 : 1) от каждого самца, т. е. расход спермы (4,5 мл неразбавленной протектором спермы на 20–25 г) был в несколько раз выше, чем при оплодотворении икры нативной спермой в производственных условиях (30 мл на 1 кг). Четвертый этап включал процессы обесклеивания икры, инкубации в аппарате «Осетр» с обработкой противогрибковыми препаратами, отбором, удалением и учетом пораженной сапролегнией икры и поштучным пересчетом выклевывающихся личинок (стадия 36). Определение процента оплодотворения (% оплодотворения) проводили на стадии четырех бластомеров (1–2 стадия развития), процент нормального развития эмбрионов (% НРЭ) определяли на стадии малой желточной пробки (16 стадия) [21]. На этом этапе использовались стандартные производственные методы, рассчитанные на работу с большими объемами икры. Температура воды во время инкубации – 13–14 °С. Период эмбрионального развития составил около 11 суток. На пятом этапе личинок выдерживали в жестко закрепленных ящиках аппарата «Осетр» до стадии 44, предшествующей началу экзогенного питания. Температура воды в период выдерживания личинок постепенно возрастала от 15 до 17–18 °С в конце эксперимента. На 44-й стадии количество эндогенного желтка (имеющего материнский генотип) сокращалось до минимума и начинали проявляться особенности индивидуального генотипа. В конце эксперимента личинок пересчитали поштучно и заморозили для генетического анализа. Всего в опытах участвовали 2 самки и 6 самцов, от которых получено около 4 тыс. личинок и подвергнуто генетическому анализу 576 шт. Генетико-биохимические исследования проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле [22]. Этот метод позволяет охарактеризовать как индивидуальные генотипы рыб, так и уровень гетерогенности и аллельного разнообразия изоферментов исследуемой выборки в целом [23, 24]. О важной роли изоферментов в регуляции метаболических процессов свидетельствует изменение их спектра под влиянием различных воздействий и физиологических состояний (охлаждение, гипоксия и др.). Как отмечается в ряде работ, многие протеолитические и эстеролитические ферменты могут адекватно демонстрировать адаптационные возможности организма [15, 17, 25–28]. Поскольку изоферменты различаются по своим свойствам (оптимуму рН, активации ионами, сродству к субстратам, ингибиторам, активаторам, кофакторам), то характер их электрофоретического спектра отражает регуляторные механизмы, контролирующие метаболизм [7, 17, 25]. В качестве генетических маркеров использовали 2 полиморфные ферментные системы: малатдегидрогеназу (МДГ) и эстеразу (Эст), у которых уже на личиночной стадии фенотипически проявляются индивидуальные, а не только материнские спектры аллозимов. Генетическую гетерогенность выборок оценивали по частоте встречаемости аллелей, уровню гетерозиготности – наблюдаемой Ноb и ожидаемой Не, критерию χ2 [29]. Данные по частотам генов были проанализированы с помощью теста χ2 на гетерогенность Д. В. Ниля и У. Д. Шелла [30], часто применяемого в популяционной генетике [23, 24, 29]. Результаты исследований и их обсуждение Показатели активности спермы, использованной в опыте 1 (самцы 1–3) и опыте 2 (самцы 4–6) до и после криоконсервации, свидетельствуют о высоком качестве нативной спермы и ее существенном ухудшении после замораживания/размораживания (табл. 1). Таблица 1 Характеристика самцов и полученной от них спермы (до и после криоконсервации) № самца Масса, кг Визуальная оценка спермы, балл Концентрация спермиев, млн/мм3 Время сохранения подвижности нативной спермы, мин Доля спермиев, совершающих поступательное движение, % Нативная Размороженная 1 9,6 3 0,74 ± 0,26 12 90 20 2 8,5 4 1,07 ± 0,11 6 95 30 3 7,5 3–4 0,74 ± 1,07 10 90 25 4 10,2 3–4 0,91 ± 1,18 5 95 25 5 8,5 4 1,07 ± 0,11 6 95 30 6 7,4 3–4 0,6 ± 1,00 9 90 25 Однако использование криоконсервированной спермы слабо отразилось на показателях оплодотворения икры (снижение на 5–7 %), поскольку при оплодотворении низкую концентрацию и подвижность криоспермиев компенсировали увеличением их численности (количеством спермадоз) (табл. 2). Наблюдения за эмбриональным и постэмбриональным развитием опытных и контрольных вариантов показали, что использование криоконсервированной спермы приводит к увеличению смертности, прежде всего на самых ранних этапах развития. У 49 % «криоэмбрионов» в опыте 1 и 29 % в опыте 2 развитие прекратилось до 16-й стадии, поэтому % НРЭ в обоих опытных вариантах был в 1,5–2 раза ниже, чем в контроле, с последующим снижением показателей вылупления личинок (табл. 2). Следовательно, уже на стадиях дробления и гаструляции начинается нарушение развития и идет отбор жизнеспособных «криоэмбрионов». Таблица 2 Результаты наблюдений за развитием эмбрионов и личинок русского осетра, полученных из икры, оплодотворенной криоконсервированной или нативной спермой № варианта Вариант % оплодотво- рения % НРЭ Выход личинок, % Выдерживание личинок, % Выход личинок 44-стадии от икры, % Норма Уроды 36-я стадия 44-я стадия 1 Контроль 1 99 98 80,8 6,6 100 98,4 72,8 Опыт 1 92 43 38,6 3,6 100 79,2 30,6 2 Контроль 2 100 99 89,6 1,3 100 97,7 71,2 Опыт 2 95 66 44,8 0,46 100 97,1 43,5 На постэмбриональных стадиях развития только в опыте 1 проявилась более высокая смертность у личинок, полученных с использованием криоконсервированной спермы, – на 20 %. В варианте 2 смертность личинок в опыте и контроле практически не различалась. Таким образом, в вариантах с использованием криоконсервированной спермы выживаемость личинок до достижения 44-й стадии была почти в 2 раза ниже, чем в соответствующих контрольных вариантах, при этом основной отбор эмбрионов происходит до 16-й стадии развития. Это свидетельствует о том, что уже на первых этапах развития в «криопотомстве» происходит определенный отбор на выживаемость. Исследование генетической гетерогенности выживших личинок показало, что аллозимы исследованных ферментных систем дифференцированно реагируют на криовмешательство в процесс размножения (табл. 3, 4). По частотам встречаемости аллелей локуса МДГ в проведенных опытах и контроле не выявлено достоверных различий. Однако в опыте 1 наблюдается увеличение гетерозиготности на 31 % и изменение соотношения частот генотипов гомо- и гетерозиготных генотипов АА и АВ в сторону увеличения гетерозигот почти в 2 раза. В опыте 2 такого явления не наблюдается, видимо потому, что у личинок второго варианта в контроле частота встречаемости гетерозиготного генотипа АВ почти в 3 раза выше, чем в опыте 1 и отмечена более высокая гетерозиготность. Поэтому изменение соотношения частот аллелей в локусе МДГ у личинок в опыте 2 было менее выражено в условиях оплодотворения криоконсервированной спермой (табл. 3). В обоих вариантах отмечается тенденция к увеличению количества гетерозигот МДГ. При этом значения χ2 в опытах и контроле выше допустимых. Следовательно, не выполняется закон Харди – Вайнберга о равновесном состоянии популяций (выборок), и они находятся под влиянием отбора (табл. 3). Таблица 3 Частота встречаемости генотипов и аллелей МДГ у личинок русского осетра в опыте и контроле Генотип АА АВ АС ВВ ВС СС N рА рВ рС Но Не χ2 D* Опыт 1 32 50 20 45 0 0 147 0,456 ± 0,03 0,476 ± 0,03 0,068 ± 0,02 0,476 ± 0,04 0,561 ± 0,01 30,3 –0,151 ± 0,07 Контроль 1 48 27 22 53 0 0 150 0,486 ± 0,03 0,443 ± 0,03 0,073 ± 0,02 0,327 ± 0,04 0,564 ± 0,01 67,9 –0,42 ± 0,05 Опыт 2 8 85 4 40 0 0 137 0,383 ± 0,03 0,602 ± 0,03 0,015 ± 0,01 0,649 ± 0,04 0,490 ± 0,02 23,1 +0,32 ± 0,06 Контроль 2 18 82 6 36 0 0 142 0,437 ± 0,03 0,542 ± 0,03 0,021 ± 0,01 0,620 ± 0,04 0,515 ± 0,01 14,8 +0,20 ± 0,07 * D – отклонение от ожидаемой гетерозиготности. По локусу Эст в первом варианте эксперимента по всем генетическими показателям опыта и контроля не обнаружено различий, однако в опыте 1 полностью отсутствует аллель е. Во втором варианте, согласно тесту на гетерогенность, наблюдаются достоверные различия по частоте встречаемости аллеля а (8,2 при р < 0,01) и аллеля е (8,34 при р < 0,01), и доля гетерозигот в опыте на 30 % превышает таковую в контроле. Все выборки, согласно критерию χ2, находятся в неравновесном состоянии и, следовательно, подвергаются влиянию отбора (табл. 4). Таблица 4 Частота встречаемости генотипов и аллелей Эст у личинок русского осетра в опыте и контроле Генотип а ае е Количество, шт. ра ре Но Не χ2 D Опыт 1 61 86 0 147 0,707 ± 0,26 0,292 ± 0,02 0,585 ± 0,04 0,413 ± 0,02 25,1 +0,413 ± 0,06 Контроль 1 70 84 7 161 0,695 ± 0,03 0,305 ± 0,03 0,524 ± 0,04 0,423 ± 0,02 8,7 +0,232 ± 0,07 Опыт 2 32 130 0 162 0,598 ± 0,03 0,402 ± 0,01 0,802 ± 0,03 0,480 ± 0,01 72,7 +0,67 ± 0,03 Контроль 2 57 74 1 132 0,713 ± 0,03 0,287 ± 0,03 0,560 ± 0,04 0,410 ± 0,03 17,9 +0,367 ± 0,07 В данном локусе разница генетических параметров между контрольными выборками несущественна. Однако во втором варианте опыта наблюдается явный отбор в пользу гетерозигот ае, что подчеркивает общую тенденцию к увеличению гетерозиготности. В целом опыты по оплодотворению икры криоконсервированной спермой показали в опытных вариантах достоверное снижение доли нормально развивающихся эмбрионов – с 98–99 % в контроле до 43 и 66 % в опыте, уменьшение выживаемости личинок «от икры» до достижения 44-й стадии в первом опыте на 58 % по сравнению с контролем, во втором – на 39 %, а также увеличение доли некоторых гетерозигот и гетерозиготности по исследованным локусам. Таким образом, процесс замораживания/размораживания является для спермиев существенным стрессовым фактором, который обусловливает селективную смертность потомства и избирательное влияние криоконсервации на генофонд. В условиях применения криотехнологий отбор проходит на следующих этапах: подготовки к замораживанию (влияние криопротекторов); замораживания (важнейший фактор – режим понижения температуры); хранения; размораживания; активизации спермы водой; оплодотворения икры; в периоды эмбрионального и постэмбрионального развития. Полученные данные показали, что только в процессе замораживания/размораживания спермы из процесса размножения исключается 75–80 % мужских гамет (см. табл. 1). На этапе развития икры погибает около 40–60 % эмбрионов, следовательно, остается 10–15 % от начального количества криоспермиев (табл. 2). На этапе развития личинок отход сравнительно небольшой (от 3 до 20 %), но в конечном итоге от исходных «криоспермиев» остается чуть больше 10 %, которые и внесут свой вклад в генофонд потомства (см. табл. 2). В это же время вклад нативных спермиев составляет не менее 70 %. Следовательно, даже в условиях нашего опыта с относительно высокими показателями выживаемости эмбрионов и личинок, подтвердилось предположение о селективном выживании как «криоспермиев», так и «криопотомства». Это обстоятельство подтверждает известный факт высокого эмбрионального отбора «криозигот» и наличие более низкого выхода личинок при оплодотворении икры криоконсервированной спермой [2–5, 8, 9]. При этом естественно предположить, что использование различных криопротекторов и технологий замораживания/размораживания может по-разному влиять на генофонд потомства. Исследование генетических показателей опытного и контрольного потомства показало преимущество в данных условиях гетерозиготных генотипов по исследованным локусам. Следует обратить внимание также на то, что менее распространенный гомозиготный генотип е по локусу Эст у «криоличинок» обнаружен не был, поэтому использование криотехнологий в процессе размножения осетровых рыб можно рассматривать как жесткое воздействие, в условиях которого происходит увеличение доли гетерозигот в потомстве. Однако сравнение результатов двух вариантов опыта, показавших разную интенсивность смещения соотношения частот генотипов по МДГ и Эст, позволяет предположить, что направление и интенсивность отбора могут быть связаны с особенностями генотипов родителей, другими изоферментами, а также комплементарностью, полимерным воздействием и другими взаимодействиями генов. Отсутствие генетического равновесия во всех выборках и смещение равновесия D в основном в пользу гетерозигот свидетельствуют о наличии как стрессового отбора в опытах, так и естественного отбора в контроле. Избирательная эмбриональная смертность (отбор) менее приспособленных генотипов в процессе онтогенетического развития, выявленная в контрольных выборках, присуща всему живому – человеку, животным, насекомым, растениям [15, 23, 26, 31], поэтому и в данном эксперименте мы наблюдаем, что в колеблющихся или стрессовых условиях среды любой отбор создает оптимальное для нее соотношение генотипов [10, 15, 26, 31]. Полученные данные, несмотря на предварительный характер экспериментов, свидетельствуют об изменении генетической структуры криопотомства в сторону увеличения доли гетерозигот как более устойчивых к вредным воздействиям. Подобная селективность (в сторону преобладания гетерозигот) присуща рыбоводному процессу и является весьма нежелательным фактором, поскольку увеличение гетерозиготности по сравнению с исторически сложившимся оптимумом, характерным для нетронутых популяций, ведет к нарушению популяционной структуры и снижению численности вида. Более гетерозиготные особи, как правило, мельче, менее плодовиты, имеют более короткий жизненный цикл, отличаются повышенной скоростью роста в начале жизненного цикла и, таким образом, более приспособлены к неоптимальным условиям среды [12–16]. Есть также данные, что гетерозиготы по локусу эстераз различных органов являются менее приспособленными по сравнению с гомозиготами [27]. Следовательно, молодь, полученная с использованием криоконсервированной спермы, оказывается менее соответствующей исторически сложившемуся генетическому оптимуму даже по сравнению с обычной заводской молодью. Заключение В настоящее время связь генетической структуры популяции с ее приспособленностью и численностью не вызывает сомнения, поэтому увеличение или элиминация каких-то определенных генотипов в процессе замораживания/размораживания является весьма принципиальным моментом, если криопотомство будет выпускаться в природные водоемы. В связи с этим, на наш взгляд, применение криоконсервированной спермы при искусственном воспроизводстве осетровых целесообразно ограничить товарными хозяйствами. Для снижения селективной смертности генетического материала в процессе криоконсервации необходимо продолжить экспериментальную работу по определению наиболее щадящих режимов замораживания/оттаивания осетровой спермы и изучение влияния использования такой спермы на генофонд потомства.
References

1. Ponomareva E. N., Bogatyreva M. M., Tihomirov A. M. Ispol'zovanie kriokonservirovannogo geneticheskogo materiala dlya vosproizvodstva osetrovyh ryb // Tez. dokl. Mezhdunar. konf. (20–22 aprelya 2010 g. Sankt-Peterburg, FGNU GosNIORH). – SPb.: Nestor-Istoriya, 2010. – S. 172–173.

2. Ponomareva E. N., Bogatyreva M. M., Tihomirov A. M. Ispol'zovanie kriokonservirovannoy spermy pri iskusstvennom vosproizvodstve osetrovyh ryb v ustanovkah zamknutogo vodoobespecheniya // Aktual'nye problemy obespecheniya prodovol'stvennoy bezopasnosti yuga Rossii: innovacionnye tehnologii dlya sohraneniya bioresursov, plodorodiya pochv, melioracii i vodoobespecheniya: materialy Mezhdunar. nauch. konf. (27–30 sent. 2011 g., Rostov-na-Donu). – Rostov n/D: YuNC RAN, 2011. – S. 100–101.

3. Trenkler I. V., Lunev G. E. Ocenka zhiznesposobnosti embrionov i lichinok russkogo osetra pri ispol'zovanii defrostirovannoy spermy // Materialy konf. «Sovremennoe sostoyanie bioresursov, 7–9 okt. – Novosibirsk: Izd-vo IIC GNU SibNSHB Rossel'hozakademii, p. Krasnoobsk, 2010. – S. 171–173.

4. Cryopreservation and short-term staroge of sturgeon sperm, a review / R. Billard, J. Cosson, S. B. Noveiri, M. Pourkazemi // Aquaculture. – 2004. – N 236. – P. 1–9.

5. Akimochkina T. I. Citologicheskie osobennosti spermiev cennyh vidov ryb Volgo-Kaspiyskogo basseyna i ih izmenenie v zavisimosti ot usloviy kriokonservacii: avtoref. dis. … kand. biol. nauk. – Astrahan', 2010. – 24 s.

6. Zemkov G. V., Akimochkina T. I. Citomorfologicheskie i funkcional'nye izmeneniya spermiev russkogo osetra (Acipenser güldenshtädti V.) posle kriokonservacii // Citologiya. – 2009. – T. 51, № 11. – S. 945–952.

7. Hochachka P., Somero Dzh. Biohimicheskaya adaptaciya. – M.: Mir. – 568 s.

8. Savushkina S. I., Cvetkova L. I., Pronina N. D. Ispol'zovanie rekonservirovannoy spermy pri vosproizvodstve ryb i ee vliyanie na rybovodno-biologicheskie kachestva potomstva // Tez. dokl. I kongressa ihtiologov Rossii (sentyabr' 1997 g., Astrahan'). – M.: VNIRO, 1997. – S. 299.

9. Savushkina S. I. Vyraschivanie ryboposadochnogo materiala, poluchennogo s ispol'zovaniem kriokonservirovannoy spermy // Materialy nauch.-prakt. konf. «Racional'noe ispol'zovanie presnovodnyh ekosistem – perspektivnoe napravlenie realizacii nacional'nogo proekta «Razvitie APK» (17–19 dekabrya 2007 g.). – M.: Rossel'hozakademiya, 2007. – S. 303–305.

10. Altuhov Yu. P. Vnutrividovoe geneticheskoe raznoobrazie: monitoring i principy sohraneniya // Genetika. – 1995. – T. 31. – S. 1333–1357.

11. Altuhov Yu. P., Evsyukov A. N. Pereproizvodstvo molodi rybovodnymi zavodami kak prichina degradacii volzhskogo stada russkogo osetra // DAN SSSR. – 2001. – T. 380, № 2. – S. 273–275.

12. O vozmozhnom vliyanii rybovodstva na geneticheskie i biologicheskie harakteristiki sevryugi / G. D. Ryabova, M. V. Oficerov, V. O. Klimonov i dr. // Sostoyanie i perspektivy nauchno-prakticheskih razrabotk v oblasti marikul'tury Rossii. – M.: VNIRO, 1996. – S. 269–274.

13. Vliyanie rybovodstva na genotipicheskie i fenotipicheskie harakteristiki volzhskoy pozdney yarovoy sevryugi / G. D. Ryabova, V. O. Klimonov, K. I. Afanas'ev i dr. // Akvakul'tura osetrovyh ryb: dostizheniya i perspektivy razvitiya. – M.: VNIRO, 2006. – S. 213–216.

14. Altuhov Yu. P. Geneticheskie posledstviya selektivnogo rybolovstva i rybovodstva // Voprosy rybolovstva. – 2000. – T. 2, № 4 (8). – S. 562–603.

15. Varnavskaya N. V. Geneticheskaya differenciaciya populyaciy tihookeanskih lososey. – Petropavlovsk-Kamchatskiy: Izd-vo KamchatNIRO, 2006. – 488 s.

16. Ryabova G. D., Klimonov V. O., Shishanova E. I. Geneticheskaya izmenchivost' v prirodnyh populyaciyah i domesticirovannyh stadah osetrovyh ryb Rossii. Atlas allozimov. – M.: Rossel'hozakademiya, 2008. – 94 s.

17. Biohimicheskie markery ryb: spravochnik / pod. red. E. V. Mikodinoy. – M.: VNIRO, 2011. – 148 s.

18. Kazakov R. V., Obrazcov A. N. Metody ocenki polovyh kletok ryb: rybovodnaya ocenka spermy // Obz. inf. Ser.: Marikul'tura. – VNIERH, 1990. – № 4. – S. 1–54.

19. Metodicheskie rekomendacii dlya stimulyacii sozrevaniya samok i samcov osetrovyh ryb na rybovodnyh zavodah del'ty Volgi: sost. I. V. Trenkler. – SPb.: ShiK, 2010. – 44 s.

20. Lunev G. E. Ispol'zovanie metilovogo spirta dlya kriokonservacii spermy russkogo osetra // Materialy 3-y nauch.-prakt. konf., 13–15 okt. 2009 g. – Astrahan': KaspNIRH, 2009. – S. 131–132.

21. Detlaf T. A., Ginzburg A. S., Shmal'gauzen O. I. Razvitie osetrovyh ryb. (Sozrevanie yaic, oplodotvorenie, razvitie zarodyshey i predlichinok). – M.: Nauka, 1981. – 224 s.

22. Peacock A. C., Bunting S. L., Queen K. G. Serum protein electrophoresis in acrylamide gel // Sciense. – 1965. – Vol. 147. – P. 1451–1543.

23. Zhivotovskiy L. A. Problemy analiza kompleksa priznakov // Ekologicheskaya genetika i evolyuciya: sb. nauch. tr. – Kishinev: Shtiinca, 1987. – S. 134–177.

24. Altuhov Yu. P., Salmenkova E. O., Omel'chenko V. T. Populyacionnaya genetika lososevyh ryb. – M.: Nauka, 1997. – 288 s.

25. Genetika izofermentov / L. I. Korochkin, O. L. Serov, A. I. Pudovkin i dr. – M.: Nauka, 1977. – 275 s.

26. Golubcov A. S. Vnutripopulyacionnaya izmenchivost' zhivotnyh i belkovyy polimorfizm. – M.: Nauka, 1988. – 168 s.

27. Sravnitel'noe biohimicheskoe izuchenie dvuh allopatricheskih populyaciy sevryugi / E. V. Kuz'min, V. I. Luk'yanenko, A. S. Vasil'ev i dr. // Osetrovye na rubezhe 21 veka: materialy Mezhdunar. konf. – Astrahan': KaspNIRH, 2000. – S. 161–162.

28. Ontogeneticheskie osobennosti ekspressii karboksiesteraz u Drosophila melanogaster / Andrievskiy A. M., Kucherov V. A., Tockiy V. N., Derkach E. V. // Visnik ONU. – 2005. – T. 10, vip. 5. – Biologiya. – S. 26–35.

29. Ayala F. Vvedenie v populyacionnuyu i evolyucionnuyu genetiku. – M.: Mir, 1984. – 232 s.

30. Nil' D. V., Shell U. D. Nasledstvennost' cheloveka. – M.: Izd-vo inostr. lit., 1958. – 389 s.

31. Shvarc S. S. Ekologicheskie zakonomernosti evolyucii. – M.: Nauka, 1980. – 278 s.


Login or Create
* Forgot password?