PRODUCING ENZYMATIC HYDROLYZATE FROM FRESHWATER MOLLUSC DREISSENA POLYMORPHA
Rubrics: TECHNOLOGY OF HYDROCOLE PROCESSING
Authors:
1.
All-Russian Research Institute of Fisheries and Oceanography
(Head of the Division of Processing Technology for Aquatic Living Resources)
2.
All-Russian Research Institute of Fisheries and Oceanography
3.
Azov Research Institute of Fishery, Kerch Branch ("YugNIRO")
4.
Azov Research Institute of Fishery, Kerch Branch ("YugNIRO")
Type:
Article
Pages:
from 101
to 111
Status:
Published
Received:
05.06.2019
Accepted:
25.06.2019
Published:
25.06.2019
Subject area:
UDK 664.959.2:594.1
GRNTI 34.39 Физиология человека и животных
GRNTI 62.13 Биотехнологические процессы и аппараты
GRNTI 69.01 Общие вопросы рыбного хозяйства
GRNTI 69.25 Аквакультура. Рыбоводство
GRNTI 69.31 Промышленное рыболовство
GRNTI 69.51 Технология переработки сырья водного происхождения
GRNTI 87.19 Загрязнение и охрана вод суши, морей и океанов
GRNTI 34.39 Физиология человека и животных
GRNTI 62.13 Биотехнологические процессы и аппараты
GRNTI 69.01 Общие вопросы рыбного хозяйства
GRNTI 69.25 Аквакультура. Рыбоводство
GRNTI 69.31 Промышленное рыболовство
GRNTI 69.51 Технология переработки сырья водного происхождения
GRNTI 87.19 Загрязнение и охрана вод суши, морей и океанов
Language:
Russian
Keywords:
mollusk, dreissena, fermentolysis, protease protozyme, amine nitrogen, degree of hydrolysis, food additive
Abstract (English):
Pipelines, mechanisms and hydraulic structures laid on the bottom of freshwater bodies are exposed to massive exposure of fouling organisms - mollusks Dreissena polymorpha . Such fouling hinders the equipment operation and increases the corrosion of materials, besides, utilization of mollusks ( Dreissena polymorpha ) requires financial expenditure. Therefore, to solve the problem, dreissena was suggested to be used as a raw material for producing enzymatic hydrolyzate. The data of the mass-size and chemical composition of the raw materials (dreissena flesh) are presented. During the analysis of the model of a 2-factor experiment (the amount of enzyme preparation and the duration of fermentolysis were taken as factors) there was defined the optimal amount of enzyme (bacterial protease - protozyme). The comparative analysis of a control sample (without adding the enzyme) and enzymatic hydrolyzates of dreissena was carried out. There was stated the increase in protein content (3.7-17.8%), in dry matter (7.0-22.7%), amine nitrogen (446.2-158.6 mg/100 g). The periods of the most intensive increase in the degree of hydrolysis (during the first 2 hours of enzymatic hydrolysis by 2.8% and further 3-4 hours by 1.2%), as well as periods of values stabilization (during 2-3 hours and after 4 hours of enzymatic hydrolysis an increase by 0.6% on average). The change in the optical density of hydrolyzate solutions and their TCA-filtrates has been studied, which helped to compare the degree of protein destruction. There has been presented the technological chart of producing enzymatic hydrolyzates from dreissena with following conditions for fermentolysis: temperature 50 ºС, water ratio 1:1, quantity of enzyme protozyme 0.1% to the mass of blanched dreissena with valves, duration 3-4 hours.
Pipelines, mechanisms and hydraulic structures laid on the bottom of freshwater bodies are exposed to massive exposure of fouling organisms - mollusks Dreissena polymorpha . Such fouling hinders the equipment operation and increases the corrosion of materials, besides, utilization of mollusks ( Dreissena polymorpha ) requires financial expenditure. Therefore, to solve the problem, dreissena was suggested to be used as a raw material for producing enzymatic hydrolyzate. The data of the mass-size and chemical composition of the raw materials (dreissena flesh) are presented. During the analysis of the model of a 2-factor experiment (the amount of enzyme preparation and the duration of fermentolysis were taken as factors) there was defined the optimal amount of enzyme (bacterial protease - protozyme). The comparative analysis of a control sample (without adding the enzyme) and enzymatic hydrolyzates of dreissena was carried out. There was stated the increase in protein content (3.7-17.8%), in dry matter (7.0-22.7%), amine nitrogen (446.2-158.6 mg/100 g). The periods of the most intensive increase in the degree of hydrolysis (during the first 2 hours of enzymatic hydrolysis by 2.8% and further 3-4 hours by 1.2%), as well as periods of values stabilization (during 2-3 hours and after 4 hours of enzymatic hydrolysis an increase by 0.6% on average). The change in the optical density of hydrolyzate solutions and their TCA-filtrates has been studied, which helped to compare the degree of protein destruction. There has been presented the technological chart of producing enzymatic hydrolyzates from dreissena with following conditions for fermentolysis: temperature 50 ºС, water ratio 1:1, quantity of enzyme protozyme 0.1% to the mass of blanched dreissena with valves, duration 3-4 hours.
Keywords:
mollusk, dreissena, fermentolysis, protease protozyme, amine nitrogen, degree of hydrolysis, food additive
mollusk, dreissena, fermentolysis, protease protozyme, amine nitrogen, degree of hydrolysis, food additive
Пресноводный моллюск дрейссена (Dreissena polymorpha) относится к организмам-обрас-тателям и образует в водоемах огромные скопления на трубопроводах, оборудовании, гидротехнических сооружениях, щитах гидроэлектростанций. Такие обрастания могут вызвать затруднения с подачей воды по трубопроводам, они разрушительно действуют на конструкционные материалы, усиливая их коррозию, создают трудности в эксплуатации оборудования. В результате этого снижается срок службы оборудования и сооружений, возникает необходимость дорогостоящих ремонтов, а также остановок для очистки поверхностей [1-3]. Периодическая очистка малоэффективна, т. к. дрейссена снова быстро размножается. К тому же в результате механической очистки водоемов в районе гидротехнических сооружений образуются значительные по объему отвалы моллюска. Вследствие разложения дрейссены создается угроза биологического загрязнения (выделение аммиака, сероводорода и пр., развитие патогенной микрофлоры, паразитофауны), способного вызвать вспышку инфекционных заболеваний [1]. В связи с этим исследования по переработке дрейссены являются актуальными. Известны способы переработки дрейссены на кормовую продукцию. Одним из таких способов является получение гранулированных комбикормов на основе моллюска дрейссена для различных животных (птицы, рыбы, раков и др.). Преимущество данного способа - практически безотходная технология, результатом которой является способный длительно храниться в обычных условиях кормовой продукт, не требующий для производства дорогостоящих ингредиентов. Cодержание сырого протеина в образцах такого корма составляет в среднем 22,2 % от массы сухого вещества, что является хорошим показателем для гранулированных кормов [1]. Проведенные опыты по скармливанию минерально-белковой добавки из высушенной и измельченной дрейссены малькам карпа дали положительный эффект: средний суточный привес рыб (карпа) опытной группы, получавших добавку из дрейссены в количестве 10 % рациона, был на 43,5 % выше по сравнению с контролем [4]. При исследовании биссуса дрейссены идентифицированы уникальные пики, соответствующие его специфическим белкам (рекомбинантный белок биссуса дрейссены использовался в качестве антигена для производства поликлональных антител) [5-7]. Исследования по получению протеолитического комплекса ферментов из дрейссены проводились О. А. Литвиновой [8]. Из дрейссены выделен фермент 5-фосфодиэстераза, рекомендованный для применения в медицине в качестве лечебного препарата [9]. Исследования аминокислотного состава белка дрейссены показали, что ее белок содержит все заменимые и незаменимые аминокислоты. В работе Нгуен Хай Иен дрейссена рассматривалась как сырье для производства гидролизатов, были проведены работы по получению ферментативных гидролизатов с использованием таких ферментов, как папаин, панкреатин, флавоэнзим и Corolase® L 10 [10]. Целью данной работы было получение ферментолизатов из дрейссены в створках под действием ферментного препарата протозим. Материалы и методы Объект исследования - пресноводный двустворчатый моллюск дрейссена Dreissena polymorpha (Pallas, 1771), добытый в Веселовском водохранилище Ростовской области в январе 2018 г. Дрейссена хранилась в замороженном виде при температуре -18 ºС. Ферментолиз проводили под действием бактериальной протеазы протозим (протеаза В), содержащей неспецифическую высокоактивную эндопептидазу для гидролиза белковых веществ с получением полипептидов, пептидов и аминокислот, рН оптимум 6,5, температурный диапазон 30-55 ºС, активность 50 000 ед./г (ТУ У 24.1-32813696-016:2008). Ферментолизаты из дрейссены получали следующим образом: дрейссену мыли, сортировали от растительности и битых раковин, бланшировали на пару 3-5 мин. Бланшированную дрейссену со створками измельчали, ферментировали с протеазой протозим при гидромодуле 1:1 и температуре 50 ºС при периодическом перемешивании. Инактивировали ферменты кипячением ферментолизата в течение 3-5 мин. Охлаждали ферментолизат и выдерживали его для настаивания в течение 15-17 ч при температуре 4 ± 2 ºС. Створки отделяли процеживанием. Плотный остаток отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 4 000 об/мин. Ферментолизат упаривали не менее чем в 20 раз. Химический состав дрейссены (содержание белка, воды, липидов, золы) определяли стандартными методами [11]. Пересчет белка на общий азот (Nобщ) проводили с использованием коэффициента 6,25. Эффективность протекания процесса ферментативного гидролиза характеризовали различными методами: - аминный азот Nам (или формольно-титруемый азот) определяли методом Черногорцева [12]; - степень гидролиза (СГ), %, оценивали по количеству гидролизованного белка (отношение количества выделившегося аминного азота к общему азоту) [13, 14]: где Nам - содержание аминного азота в ферментолизате после ферментолиза в течение некоторого периода времени, мг/100 г; Nобщ - общий азот, мг/100 г. Изменение концентрации белковых продуктов в ферментолизатах определяли по изменению оптической плотности разбавленных в 500 раз растворов ферментолизатов в ультрафиолетовой области спектра, предварительно осадив высокомолекулярные белковые соединения трихлоруксусной (ТХУ) кислотой. Для этого к раствору ферментолизата добавляли 20 % ТХУ кислоту, осадок фильтровали [15]. Спектральный анализ растворов ферментолизатов и ТХУ фильтратов проводили в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм на спектрофотометре УФ-1200 относительно дистиллированной воды и приготовленного раствора ТХУ кислоты соответственно. Планирование 2-факторного эксперимента осуществляли с помощью пакета Statgraphics Plus, используя в качестве параметра поверхности отклика design name - сentral composite blocked cube-star (табл. 1). Таблица 1 План эксперимента с натуральными значениями факторов и функцией отклика Режим ферментолиза Факторы эксперимента Функция отклика Количество ферментного препарата (Х1), %, к массе бланшированного мяса дрейссены Продолжительность ферментолиза (X2), мин Nам (Y), мг/100 мг 1 0,60 225 39,2 2 0,20 90 22,4 3 1,00 90 44,8 4 0,20 360 36,4 5 1,00 360 50,4 6 0,60 225 28,0 7 0,03 225 22,4 8 1,17 225 42,0 9 0,60 34 19,6 10 0,60 415 28,0 Наименьшие и наибольшие значения факторов, заданные при планировании эксперимента, представлены в табл. 2. Таблица 2 Наименьшие и наибольшие значения факторов, заданные при планировании эксперимента Фактор Наименьшее значение Наибольшее значение Х1, % 0,2 1,0 Х2, мин 90,0 360,0 Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми методами при доверительной вероятности p ≤ 0,95 [16]. Результаты и их обсуждение Средняя длина дрейссены составляла 1,8 см, средняя масса - 0,65 г (рис. 1). Рис. 1. Внешний вид пресноводного моллюска дрейссены Из-за загрязненности дрейссены илом, травой, обрастаниями потери при мойке и сортировании дрейссены составили 44,1 %. Общие потери с учетом размораживания и мойки - 50,2 %. Масса сырого тела моллюска составляла 14 % от массы моллюска. Средний выход бланшированного мяса - 11-17,5 % от массы бланшированной дрейссены. Мясо дрейссены мороженое характеризуется низким содержанием липидов и белка, бланшированное мясо содержит значительное количество белка (табл. 3). Таблица 3 Химические показатели мяса дрейссены Сырье Химические показатели Белок, % Nобщ, мг/100 г Вода, % Сухие вещества, % Липиды, % Зола, % Nам, мг/100 г рН Мясо дрейссены мороженое (без створок) 5,6 896,0 91,6 8,4 0,4 1,1 11,2 6,8 Мясо дрейссены бланшированное (без створок) 17,3 2 768,0 72,7 27,3 0,4 8,0 67,1 7,0 Вследствие нейтрального значения рН фарша из мяса дрейссены и использования протеазы, проявляющей наибольшую активность в диапазоне нейтральных рН, необходимости понижать или повышать рН не было. Ферментолиз проводили при естественных значениях рН сырья. В результате проведения исследований согласно плану эксперимента (см. табл. 1) получена математическая модель, которая (с точностью R-squared = 98,3 %) описывает исследуемую зависимость: Y = 7,78134 + 14,3498·X1 + 0,108654·X2 + 12,031·X12 - 0,0388889·X1·X2 - 0,000124828·X22. Поверхность отклика Nам от заданных факторов эксперимента представлена на рис. 2. Рис. 2. Поверхность отклика (зависимость значений аминного азота ферментолизата дрейссены от количества ферментного препарата и продолжительности ферментолиза) Программой определено решение - параметры ферментолиза, при которых достигается максимум значения функции отклика (Nам): - количество ферментного препарата - 1,1 % к массе бланшированного мяса дрейссены; - продолжительность ферментолиза - 253 мин (4,2 ч). Учитывая, что средний выход бланшированного мяса из размороженной дрейссены составил 12 %, для удобства расчета полученное количество ферментного препарата было пересчитано относительно бланшированной дрейссены со створками, оно составило 0,1 %. С целью уточнения продолжительности ферментолиза, при которой происходит замедление процесса накопления аминного азота, изучены характеристики ферментолизатов в течение 2-5 ч ферментолиза в сравнении с образцом-контролем (без добавления ферментного препарата) (параметры ферментолиза: температура 50 ºС, гидромодуль 1:1, количество ферментного препарата - 0,1 % к массе бланшированной дрейссены со створками). Результаты исследований представлены на рис. 3 и в табл. 4. Рис. 3. Зависимость накопления аминного азота от продолжительности ферментолиза дрейссены Таблица 4 Химические показатели ферментолизатов дрейссены и образца-контроля Образцы ферментолизатов Показатели Белок, % Nобщ, мг/100 мг Вода, % Сухие вещества, % Контроль 3,7 584,0 93,0 7,0 2 ч ферментолиз 17,7 2 824,0 77,7 22,3 3 ч ферментолиз 17,8 2 840,0 77,7 22,4 4 ч ферментолиз 18,1 2 896,0 76,9 23,1 5 ч ферментолиз 17,4 2 776,0 77,3 22,8 С увеличением продолжительности ферментолиза происходит постепенное накопление аминного азота в ферментолизатах. В исследуемых образцах в течение 2-3 ч ферментолиза содержание аминного азота увеличивается в 3 раза, за 4-5 ч - в 4 раза по сравнению с контролем. Значения белка (общего азота) образцов 2-5 ч ферментолиза в среднем в 5 раз больше, чем в контроле, что указывает на протекание процессов расщепления белков, полипептидов под действием ферментного препарата и на переход азотистых соединений в ферментолизат. Существенных различий в содержании белка (общего азота) в образцах с различной продолжительностью ферментолиза не выявлено. Выход ферментолизата во всех образцах был примерно одинаковым и в среднем составил 3,5 % от массы бланшированной дрейссены со створками. Плотный остаток в образцах с ферментным препаратом составил 5,8 % от массы бланшированной дрейссены со створками, в контрольном образце - лишь 1,9 %. Такое различие, вероятно, можно объяснить тем, что в образце-контроле непрогидролизованное мясо моллюска было отделено вместе со створками при процеживании и в плотный остаток не попало. Содержание белка в плотном остатке в среднем составляет 7,2 % при массовой доле воды 70,8 %, поэтому плотный остаток в виде влажной пасты, высушенной крупки, порошка или гранул может быть использован в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птиц, а также в качестве компонента различных комбикормов. Степень гидролиза ферментолизатов находится в пределах 4,4-6,7 % (рис. 4). Рис. 4. Степень гидролиза в образце-контроле и 2-5 ч ферментолизатах дрейссены Поскольку степень гидролиза наиболее интенсивно увеличивается в течение первых 2 ч (на 2,8 %) и 3-4 ч (на 1,2 %) ферментолиза, а в течение 2-3 ч и после 4 ч ферментолиза отмечается стабилизация значений степени гидролиза (увеличение на 0,6 и 0,5 % соответственно), ферментолиз целесообразно проводить продолжительностью от 2 до 4 ч. Одним из способов оценки степени деструкции белков в ферментолизатах считается изменение оптической плотности растворов за счет ТХУ неосаждаемых низкомолекулярных пептидов (белковые соединения с молекулярной массой более 2 кДа под действием раствора ТХУ кислоты выпадают в осадок) [14]. Результаты исследований оценки эффективности ферментолиза спектральным методом представлены на рис. 5. Рис. 5. Изменение оптической плотности ферментолизатов и их ТХУ фильтратов в зависимости от продолжительности ферментолиза В образцах с ферментным препаратом спектры ТХУ фильтратов на графике располагаются ниже (меньше оптическая плотность), чем спектры этих же растворов ферментолизатов. Спектры образца-контроля не имеют такой зависимости. Технологическая схема производства ферментолизата из дрейссены представлена на рис. 6. Рис. 6. Технологическая схема производства ферментолизата из дрейссены В зависимости от технических характеристик используемого оборудования режимы некоторых операций могут меняться (в частности, бланширования, центрифугирования, фасования). Заключение Пресноводный двустворчатый моллюск дрейссена Dreissena polymorpha, добытый в Веселовском водохранилище Ростовской области в январе 2018 г., характеризуется небольшими размерами (средняя длина составляет 1,8 см, масса - 0,65 г). Химический состав мороженого (содержание белка 5,6 %, воды 91,6 %, золы 1,1 %) и бланшированного (содержание белка 17,3 %, воды 72,7 %, золы 8,0 %) мяса дрейссены значительно отличается, кроме содержания липидов (0,4 %). Анализом модели 2-факторного эксперимента (факторами выбраны количество ферментного препарата и продолжительность ферментолиза) получено уравнение и поверхность отклика, описывающие исследуемую зависимость (Nам от заданных факторов). Установлено оптимальное количество ферментного препарата протозим, необходимого для проведения ферментолиза - 0,1 % к массе бланшированной дрейссены со створками. Получены образцы ферментолизатов дрейссены, которые характеризуются большим содержанием белка (в среднем 17,8 %), сухих веществ (22,7 %), аминного азота (158,6 мг/100 г), чем образец-контроль (3,7; 7,0 и 46,2 % соответственно). Установлено наиболее интенсивное увеличение значений степени гидролиза в течение первых 2 ч (на 2,8 %) и 3-4 ч (на 1,2 %) ферментолиза со стабилизацией значений в течение 2-3 ч и после 4 ч ферментолиза (увеличение на 0,6 и 0,5 % соответственно). Изучено изменение оптической плотности растворов ферментолизатов и их ТХУ фильтратов, что позволяет в сравнении оценить степень деструкции белков. Отмечена возможность использования плотного остатка ферментолизатов дрейссены в виде влажной пасты, высушенной крупки, порошка или гранул в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птиц или компонента различных комбикормов (содержание белка составляет в среднем 7,2 % при массовой доле воды 70,8 %). Составлена технологическая схема производства ферментолизата из дрейссены с проведением ферментолиза по следующему режиму: температура 50 ºС, гидромодуль 1:1, количество ферментного препарата протозим 0,1 % к массе бланшированной дрейссены со створками, продолжительность 2-4 ч.
1. Gamaga V. V., Kablov V. F., Kostin V. E., Rodionov S. N., Sokolova N. A. Uluchshenie ekologicheskoy situacii v rayonah gidrotehnicheskih sooruzheniy za schet sbora i utilizacii mollyuskov roda Dreyssena. URL: https: //cyberleninka.ru/article//uluchshenie- ekologicheskoy- situatsii-v-rayonah-gidrotehnicheskih -sooruzheniy-za-schet-sbora-i-utilizatsii-mollyuskov- roda-dreyssena (data obrascheniya: 16.11.2018).
2. Pat. RF № 2478114. Mnogosloynoe kombinirovannoe protivoobrastayuschee pokrytie, obespechivayuschee repellentno-hemobiocidnuyu zaschitu / Beznosov V. N., Suzdaleva A. L., Mityaeva Yu. D., Minin D. V., Kotkin K. S.; opubl. 27.03.2013.
3. Kopsha A. V. Vliyanie bioobrastaniya dreyssenoy na rabotu vodozabornyh sooruzhenii // Ekologicheskie problemy i zdorov'e naseleniya: materialy Vseros. nauch.-prakt. konf. (Penza, 21-22 iyunya 2017 g.). URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=30248732 (data obrascheniya: 16.11.2018).
4. Ahmetzyanova N. Sh., Egorov Yu. E. Znachenie mollyuska dreysseny kak prirodnogo biofil'tra i kormovogo ob'ekta // Vosproizvodstvo estestvennyh populyaciy cennyh vidov ryb: tez. dokl. Mezhdunar. konf. (Sankt-Peterburg, 20-22 aprelya 2010 g.). SPb.: Izd-vo GosNIORH, 2010. S. 15-17.
5. Anderson K. E., Waite J. H. Immunolocalization of Dpfp1, a byssal protein of the zebra mussel Dreissena polymorpha. URL: http://jeb.biologists.org/content/jexbio/203/20/3065.full.pdf (data obrascheniya: 16.11.2018).
6. Gilbert T., Sone E. The byssus of the zebra mussel (Dreissena polymorpha): spatial variations in protein composition. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20924840 (data obrascheniya: 21.11.2018).
7. Gantayet A., Ohana L., Sone E. Byssal proteins of the freshwater zebra mussel, Dreissena polymorpha. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23211030 (data obrascheniya: 16.11.2018).
8. Litvinova O. A. Razrabotka tehnologii fermentnogo preparata iz mollyuska dreysseny (Dreissena polymorpha Pallas). URL: http://tekhnosfera.com/razrabotka-tehnologii-fermentnogo-preparata-iz-mollyuska-dreyssena-dreissena-polymorpha-pallas#ixzz5MB5fEUsM (data obrascheniya: 02.12.2018).
9. Pat. SSSR № 566589. Sposob polucheniya 5'-fosfodiesterazy / Berdyshev G. D., Yugay N. V., Lucenko N. A.; opubl. 1977, Byul. № 28.
10. Nguen Hay Ien. Razrabotka tehnologii fermentativnyh gidrolizatov iz presnovodnogo mollyuska dreysseny (Dreissenum polymorpha Pallas) i zelenoy midii (Perna viridis): avtoref. dis.. kand. tehn. nauk. M., 2009. 25 s.
11. GOST 7636. Ryba, morskie mlekopitayuschie, morskie bespozvonochnye i produkty ih pererabotki. Metody analiza. M.: Izd-vo standartov, 1985. 125 s.
12. Chernogorcev A. P. Pererabotka melkoy ryby na osnove fermentirovaniya syr'ya. M.: Pisch. prom-st', 1973. 90 s.
13. Razumovskaya R. G. Poluchenie gidrolizatov, belkovoy massy i koncentratov iz melkoy ryby // Rybnoe hozyaystvo. 1973. № 6. S. 66-69.
14. Muhin V. A., Novikov V. Yu. Fermentativnye belkovye gidrolizaty tkaney morskih gidrobiontov: poluchenie, svoystva i prakticheskoe ispol'zovanie. Murmansk: PINRO, 2001. 97 s.
15. Golovin A. N. Kontrol' proizvodstva rybnoy produkcii. M.: Pisch. prom-st', 1992. Ch. 1. 348 s.
16. Orlov A. I. Matematika sluchaya: veroyatnost' i statistika - osnovnye fakty. M.: MZ-Press, 2004. 110 s.
