EFFECT OF HIGH TEMPERATURE ON BLOOD PARAMETERS IN JUVENILE SILVER CARP CARASSIUS AURATUS AND AMUR SLEEPER PERCCOTTUS GLENII
Abstract and keywords
Abstract (English):
The values of the critical thermal maximum under heating rate of the water from 4 to 40 °C/h in two fish species - the three-year silver carp Carassius auratus and two-year Amur sleeper Perccottus glenii were experimentally determined. The haematological parameters (red and white blood) of fish exposed to heating were studied at the same time. The maximum values of critical thermal maximum were fixed at the lowest heating rate. For other heating rates either their relative stability (silver carp) or lowering of thermal resistance (Amur sleeper) was observed. Three-year silver carp is more heat resistant in comparison with the two-year Amur sleeper. The white blood cells (the ration of lymphocytes and immature granulocytes) and red blood cells (immature forms of erythrocytes, amitosis destroyed cells) were the most sensitive to heat indicators. The similarity of reactions to thermal effects in silver carp and Amur sleeper was observed. It was found that in white blood changes are consistent with non-specific response to the stress effect, but in red blood changes are compensatory responses to hypoxia arisen. The red blood cells after exposure to a temperature of 10 °C/h have a higher number of amitosis (by 3-5 times) and the number of damaged red blood cells (by 1.5-2 times). In white blood the number of lymphocytes decreases (by 1.5-2 times) and the number of myelocytes increases (30-45 %). The resulting data can be used in assessing the levels of thermal loading on natural water bodies and evaluation of potential opportunities of fish thermal adaptation.

Keywords:
fish, upper lethal temperature, critical thermal maximum, hematology, white blood, red blood, Amur sleeper, silver carp
Text
Введение Рыбы - пойкилотермные животные, температура их тела зависит от температуры окружающей среды. Известно, что температура влияет на скорость всех биологических процессов (рост, питание, обмен веществ) у рыб, их распределение и поведение. Значительные отклонения температуры за пределы оптимальных величин являются стресс-факторами, снижающими активность рыб и адаптационные способности организма. Кроме того, высокие значения температуры среды негативно влияют на гидрохимический режим в водоеме, способствуя снижению в воде уровня кислорода, а также провоцируя развитие сапрофитной микрофлоры и возбудителей различных болезней [1, 2]. У питающихся рыб адаптация к весеннему потеплению идет по пути снижения концентрации гемоглобина, увеличения скорости оседания эритроцитов, изменения соотношения эритроцитов и лейкоцитов, активизации эритро- и гранулопоэза [3]. Температура влияет на скорость и интенсивность фагоцитоза лейкоцитами периферической крови: низкая температура угнетает способность клеток к поглощению бактерий и снижает скорость выведения продуктов распада антигена из организма рыб [4, 5]. При понижении температуры снижается интенсивность антителогенеза, а также уменьшается эффект проявления иммунологической памяти [5]. Следует отметить, что значения оптимальной температуры максимального антителогенеза отличаются у холодо- и теплолюбивых рыб. У налима и форели (холодолюбивые рыбы) оптимальный антителогенез происходит при температуре 6-9 °С, тогда как у карпа, карася и угря (теплолюбивые виды) при данной температуре антителогенез практически не выражен [4]. Известно, что при термоадаптации гималайского барбуса (золотого махсира) Tor putitora до верхних критических температур у рыб происходит достоверное снижение концентрации и активности каталитических ферментов, кроме того, уменьшается содержание общего белка крови [6]. В то же время уровень глюкозы крови и гемоглобина линейно возрастает. Содержание белых клеток крови повышается до термического оптимума, а затем резко снижается [6]. Данные об изменении соотношения зрелых и незрелых клеток красной крови, наличия/отсутствия патологических изменений, соотношения различных типов лейкоцитов в периферической крови различных видов рыб часто отрывочны и не дают полного представления об изменениях показателей крови при изменениях температуры среды. Особый интерес у исследователей вызывают сведения о верхних летальных температурах (ВЛТ) у различных тепло- и холодолюбивых видов рыб в диапазоне от 27 до 43 °С [7-11]. Несмотря на большой объем полевых и экспериментальных данных по ВЛТ, реакция гематологических показателей рыб на экстремальные температурные условия, нагрев воды при различных значениях скорости, на возможность выживания при сублетальных значениях температуры, а также на сброс подогретых вод тепловых и атомных электростанций изучена недостаточно [12]. Цель работы - определить верхнюю температурную границу жизнедеятельности у серебряного карася Carassius auratus L. и головешки-ротана Perccottus glenii Dybowski, 1877, а также определить направление изменения показателей красной и белой крови у данных видов рыб при различных значениях скорости нагрева воды. Материалы и методики Для опытов была использованы трехлетки серебряного карася и двухлетки головешки-ротана, отловленные в прудах вблизи пос. Борок Ярославской области и в прибрежье Рыбинского водохранилища. Особей акклимировали в течение 10 суток в аквариумах с постоянной аэрацией воды при температуре ~20 °С. Рыб кормили один раз в сутки комбикормом и рыбным фаршем в количестве 5 % от массы тела рыб. После 7-дневного периода акклимации рыб с нормальной двигательной активностью («реакция избегания сачка») отбирали для экспериментов по определению критического термического максимума (КТМ). Группы рыб (по 6 особей в каждой) помещали в экспериментальный аквариум (объемом 60 л) с аэрацией и повышали температуру воды с определенной постоянной скоростью - 4,0; 8,0; 14,0; 25,0 и 40,0 °С/ч. При нагреве со скоростью 4,0; 8,0 и 14,0 °С/ч использовались кипятильники мощностью 0,3; 0,63 и 1,2 кВт соответственно. Более высокую скорость нагрева обеспечивали нагревательными элементами мощностью 2,4 и 3,6 кВт. Скорость нагрева рассчитывалась после завершения опыта по формуле Vн = t2 - t1/T, где Vн - скорость нагрева, °С/ч; t1 - температура воды в начале опыта, °С; t2 - температура воды в конце опыта, °С; T - длительность опыта, ч. Для определения значений ВЛТ использовали стандартный метод КТМ. Температуру, при которой происходил переворот тела рыбы на бок или кверху брюшком, принимали за значение КТМ [8-11]. При дальнейшем нагреве рыбы обычно вскоре погибают. Если же сразу после переворота тела снижать температуру, рыбы, как правило, выживают. Всего в общей сложности исследовали 30 особей серебряного карася (средняя длина тела 6,5 см, средняя масса 6,3 г) и 30 особей головешки-ротана (средняя длина тела 6,6 см, средняя масса 7,3 г). Мазки крови готовили из венозной крови путем каудэктомии после оглушения рыб. Высушенный на воздухе мазок фиксировали в 96-градусном спирте и окрашивали по Романовскому - Гимзе по стандартной методике [13] при рН 7,0. На мазках оценивали эритро- и лейкопоэз. Помимо этого подсчитывали количество поврежденных клеток (эритроцитов), как показатель устойчивости клеток, а также количество амитозов. При оценке эритропоэза определяли относительное количество эритроцитов разной степени зрелости: эритробластов, незрелых и зрелых эритроцитов. Подсчитывали не менее 500 клеток, результаты выражали в процентах. Одновременно вели учет амитотически делящихся эритроцитов, которые определяли по наличию гантелевидных ядер в клетках, микроцитов, а также безъядерных клеток (как результат завершенного амитоза), результат также выражали в процентах. Долю разрушенных клеток на мазке рассчитывали по отношению к общему количеству клеток красной крови. При идентификации лейкоцитов использовали классификацию Н. Т. Ивановой [14]. Процентное соотношение лейкоцитов, или лейкоцитарную формулу, определяли, подсчитывая на мазках 200 клеток белой крови. Количество тромбоцитов подсчитывали параллельно с подсчетом лейкоцитов и их долю рассчитывали, %, по формуле Трц = Трц / (Лк + Трц) · 100, где Лк - лейкоциты, Трц - тромбоциты. Результаты выражали в виде средних значений и их ошибок, достоверность оценивали по критерию Стьюдента при p ≤ 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Экспериментальные данные, полученные при определении КТМ у трехлеток серебряного карася и двухлеток головешки-ротана, приведены в табл. 1. Начальные значения КТМ (переворот первой особи) у серебряного карася наблюдались при температуре от ~35 до 37 °С. Аналогичная реакция у последних особей в каждом опыте наблюдалась в диапазоне значений температуры от 36 до 38 °С. Судя по средним значениям, максимальная термоустойчивость серебряного карася отмечена при минимальной скорости нагрева. При всех остальных значениях скорости нагрева средние значения КТМ колебались незначительно, но всегда были на 2-3 °С ниже. В сравнении с серебряным карасем двухлетки головешки-ротана оказались менее термоустойчивыми. Переворот тела на бок или кверху брюшком у первых особей в каждом опыте отмечен при разных значениях скорости нагрева в диапазоне значений температуры от ~31,5 до 34,5 °С, а у последних в каждой серии - от 34 до 36 °С. Динамика средних значений КТМ несколько отличалась от аналогичной у серебряного карася. Хотя показатель КТМ также был максимальным при самой низкой скорости нагрева воды, в дальнейшем наблюдалось некоторое (на 2,5 °С) понижение термоустойчивости. Как известно, значения КТМ отражают сублетальные уровни ВЛТ у рыб [8, 9]. Так, например, известно, что в диапазоне значений температуры от 34 до 38 °С возможный тепловой шок является для рыб «генотоксичным», поскольку вызывает увеличение частоты аберраций хромосом в метафазе, а также приводит к одноцепочечным повреждениям ДНК [15]. В зоне высокой температуры (от 30-32 до 34-35 °С и выше) питание и рост рыб явно угнетены, а возможность повреждающих и летальных последствий весьма велика [15]. Результаты по значениям КТМ при скорости нагрева 4 °С/ч у обоих видов почти совпадают с данными, приведенными в [8], что говорит о возможности устойчивого получения экспериментальных данных по ВЛТ рыб и их использования для экспертной оценки тепловой нагрузки на пресноводные водоемы. Таблица 1 Критический термический максимум у трехлеток серебряного карася и двухлеток головешки-ротана при различных значениях скорости нагрева Скорость нагрева, °С/ч У индивидуальных особей Средняя ± ошибка Серебряный карась 4 36,8 37,0 37,8 37,9 38,1 38,2 37,6 ± 0,2a 8 34,9 36,1 36,1 36,2 36,9 36,9 36,2 ± 0,3б 14 35,8 35,9 36,1 36,9 36,9 37,1 36,5 ± 0,2 б 25 34,9 35,9 35,9 36,1 36 35,9 35,8 ± 0,2б 40 36,0 36,0 36,7 36,7 36,9 36,9 36,5 ± 0,2б Головешка-ротан 4 34,7 34,9 35,8 35,9 36,1 36,1 35,6 ± 0,3а 8 32,9 34,1 33,9 34,1 34,9 34,8 34,1 ± 0,3б 14 31,9 32,8 32,8 32,8 32,9 34,1 32,9 ± 0,3в 25 31,7 33,1 32,9 34,2 34,1 34,1 33,4 ± 0,4в 40 32,1 32,1 33,0 33,0 34 34,1 33,1 ± 0,4в Примечание: Значения показателей с разными индексами в столбце достоверно различаются, p < 0,05. Результаты, полученные при исследовании клеток белой и красной крови двух видов, приведены в табл. 2 и 3. Достоверные изменения показателей крови отмечены у серебряного карася по лейкоцитам - при скорости нагрева более 8,0 °C/ч, по эритроцитам - при скорости более 4,5 °C/ч, у головешки-ротана - 14,0 и 4,5 °C/ч соответственно. Обнаружены достоверно отличающиеся от контроля лимфопения (уменьшение относительного количества лимфоцитов) и нейтрофилия (увеличение долей незрелых нейтрофилов - миелоцитов и метамиелоцитов, тогда как изменений зрелых форм нейтрофилов - палочко- и сегментоядерных нейтрофилов не наблюдали). Выявленные изменения свидетельствуют о том, что клетки белой крови реагируют на резкое повышение температуры реакцией неспецифического стресса, как на действие любых неблагоприятных абиотических и биотических, в том числе антропогенных, факторов [16]. Следует отметить, что доли бластных форм клеток при наименьшей скорости нагрева незначительно повышаются относительно контроля, а потом резко уменьшаются. Это может быть связано с дозреванием клеток и их выбросом в кровяное русло при повышении температуры воды. Среди показателей красной крови следует отметить исчезновение из периферического русла незрелых форм клеток. Данное явление также может быть связано с дозреванием эритроцитов или ускоренным выбросом зрелых клеток из «депо» в селезенке. Достоверное увеличение количества амитозов среди эритроцитов можно считать компенсаторной реакцией красной крови на дефицит кислорода при увеличении температуры воды. Подобное явление описано у карасей, обитающих в дефицитных по содержанию кислорода водоемах [14]. Амитоз, как тип деления, не связанный со сложной перестройкой хроматинового аппарата - это быстрый способ увеличения количества переносчиков кислорода. До сих пор продолжается дискуссия о том, является ли амитоз компенсаторной реакцией на дефицит кислорода, или это признак патологического состояния эритроцитов, т. к. при этом повреждается генетический аппарат клетки, и она становится неспособной к дальнейшему делению [13]. Увеличение количества поврежденных клеток на мазках крови указывает на уменьшение резистентности мембран клеток при резком повышении температуры. Отличия в развитии реакции у серебряного карася и головешки-ротана при разных значениях температуры нагрева может быть связано с их различной чувствительностью к гипоксии при повышении температуры воды. Таблица 2 Соотношение клеток красной и белой крови в периферической крови у трехлеток серебряного карася при различных значениях скорости нагрева воды, %* Показатель Скорость нагрева воды, °С/ч 0 (контроль) 4,5 8,0 14,0 25,0 40,0 Лейкоциты Лимфоциты 73,7 ± 12,2 73,7 ± 6,1 48,6 ± 4,4* 43,8 ± 4,6* 44,0 ± 4,7* 42,7 ± 4,5* Моноциты 1,7 ± 1,1 2,1 ± 1,8 2,1 ± 1,1 2,1 ± 1,0 2,0 ± 0,7 1,9 ± 0,6 Бластные клетки 4,3 ± 1,6 6,4 ±3,8 5,7 ± 2,5 2,5 ± 1,2 2,3 ± 0,9 2,0 ± 0,6 Миелоциты 10,3 ± 5,1 14,6 ±2,2 27,3 ± 5,8* 28,3 ± 4,6* 27,1 ± 3,3* 26,6 ± 1,6* Метамиелоциты 8,1 ± 5,7 5,0 ± 3,1 14,1 ± 0,5 17,3 ± 0,8* 21,0 ± 2,8* 21,5 ± 4,0* Нейтрофилы: палочкоядерные 2,3 ± 3,3 1,2 ± 2,0 2,1 ± 1,5 2,3 ± 1,1 4,1 ± 1,3 4,6 ± 1,8 сегментоядерные 2,4 ± 3,6 3,4 ± 4,4 3,2 ± 0,5 5,1 ± 2,9 2,6 ± 0,8 3,2 ± 0,5 Эритроциты Эритробласты 0,6 ± 0,6 0,1 ± 0,3 0,2 ± 0,4 0,9 ± 1,2 0,2 ± 0,5 0,1 ± 0,3 Эритроциты: незрелые 1,8 ± 1,7 0,4 ± 0,7 2,7 ± 3,6 2,4 ± 4,4 0,7 ± 1,1 0,3 ± 0,7 зрелые 97,6 ± 1,5 99,5 ± 0,7 97,0 ± 3,8 96,7 ± 4,6 99,1 ± 1,5 99,6 ± 0,7 Амитозы 2,6 ± 2,3 8,2 ± 3,4 6,1 ± 7,2 14,9 ± 0,8* 12,7 ± 1,8* 12,5 ± 0,4* Микроциты 1,2 ± 1,5 15,7 ± 6,6* 7,5 ± 5,9 14,4 ± 5,8* 12,6 ± 2,7* 12,7 ± 3,6* Поврежденные клетки 0 2,7 ± 3,8 21,4 ± 7,9* 27,8 ± 5,0* 28,0 ± 4,8 33,6 ± 7,8* * Показатели статистически достоверно отличаются от контроля, p < 0,05. Таблица 3 Соотношение клеток красной и белой крови в периферической крови у двухлеток головешки-ротана при различных значениях скорости нагрева воды, %* Показатель Скорость нагрева воды, °С/ч 0 (контроль) 4,5 8,0 14,0 25,0 40,0 Лейкоциты Лимфоциты 46,6 ± 7,0 42,0 ± 2,1 45,6 ± 5,3 26,3 ± 4,7* 25,3 ± 7,2* 22,4 ± 3,5* Моноциты 0,5 ± 0,7 0,6 ± 0,6 3,3 ± 1,6 1,9 ± 1,7 2,3 ± 0,9 1,7 ± 1,4 Бласты 0,1 ± 0,2 0,3 ± 0,3 1,0 ± 1,0 0,6 ± 0,6 0,8 ± 0,7 1,3 ± 1,1 Промиелоциты 37,7 ± 5,8 43,8 ± 6,5 33,3 ± 2,0 43,7 ± 3,6 46,2 ± 5,0 45,9 ± 3,2 Миелоциты 14,3 ± 2,2 11,6 ± 5,6 13,5 ± 4,7 20,6 ± 4,5 17,9 ± 4,5 19,6 ± 1,9 Нейтрофилы: палочкоядерные 0,4 ± 0,6 0,8 ± 0,8 2,0 ± 1,5 2,3 ± 0,9 2,3 ± 2,4 0,4 ± 0,6 сегментоядерные 0,4 ± 0,5 0,9 ± 0,7 1,3 ± 0,6 2,1 ± 1,3 1,6 ± 1,4 2,7 ± 2,0 Эритроциты Эритробласты 0 0 0,1 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0 Эритроциты: незрелые 0,1 ± 0,1 0 0,2 ± 0,3 0,4 ± 0,4 0 0,3 ± 0,5 зрелые 99,4 ± 0,9 88,9 ± 4,7 90,9 ± 2,8 86,2 ± 3,6 82,5 ± 13,6 84,7 ± 1,4 Амитозы 0,1 ± 0,2 0 1,0 ± 0,4 2,6 ± 1,6* 1,6 ± 0,7* 0,3 ± 0,5 Микроциты 0,4 ± 0,6 0 0,7 ± 0,4 1,4 ± 0,9 0,7 ± 0,5 0 Поврежденные клетки 0 11,1 ± 4,7* 7,2 ± 3,0* 9,3 ± 3,3* 15,1 ± 1,7* 14,7 ± 1,6* * Показатели статистически достоверно отличаются от контроля, p < 0,05. Таким образом, впервые на примере двух видов рыб - серебряного карася и головешки-ротана - исследованы гематологические показатели (белая и красная кровь) рыб при нагреве воды с разной скоростью. Первые полученные данные свидетельствуют о том, что некоторые гематологические показатели могут служить своеобразными маркерами температурного воздействия на рыб в зоне высоких значений температуры среды. С учетом возможного потепления климата, возникновения аномальных температурных ситуаций в водоемах и увеличения сбросов теплых вод ГРЭС и АЭС, полученные данные возможно использовать для разработки уровней допустимой тепловой нагрузки на естественные водоемы. Выводы 1. Определены значения КТМ у трехлеток серебряного карася и двухлеток головешки-ротана в летний сезон года в при скорости нагрева воды от 4 до 40 °С/ч. Максимальные значения КТМ отмечены при самой низкой скорости нагрева. При остальных значениях скорости нагрева отмечена или их относительная стабильность (серебряный карась) или понижение термоустойчивости (головешка-ротан). Трехлетки серебряного карася более термоустойчивы в сравнении с двухлетками головешки-ротана. 2. Обнаружено, что к нагреву наиболее чувствительны показатели белой крови (соотношение лимфоцитов и незрелых форм гранулоцитов) и красной крови (незрелые формы эритроцитов, амитозы, разрушенные клетки). 3. Установлено сходство реакций на температурное воздействие у серебряного карася и головешки-ротана. Показано, что изменения в белой крови соответствуют неспецифической реакции на стрессовое воздействие, а изменения в красной крови являются компенсаторными реакциями на возникшую гипоксию. 4. В красной крови после воздействия температуры более 10 °С/ч увеличивается количество амитозов (в 3-5 раз) и количество повреждённых эритроцитов (в 1,5-2 раза). В белой крови снижается количество лимфоцитов (в 1,5-2 раза) и увеличивается количество миелоцитов (на 30-45 %).
References

1. Golovina N. A. Krov' kak diagnosticheskaya sistema fiziologicheskogo sostoyaniya organizma / N. A. Golovina // Pervyy kongress ihtiologov Rossii: sb. tez. dokl. M.: VNIRO, 1997. S. 215-216.

2. Ivanov A. A. Fiziologiya ryb / A. A. Ivanov. M.: Mir, 2003. 284 s.

3. Serpunin G. G. Gematologicheskie pokazateli adaptaciy ryb: monogr. / G. G. Serpunin. Kaliningrad: Izd-vo KGTU, 2010. 460 s.

4. Mikryakov V. R. Zakonomernosti formirovaniya priobretennogo immuniteta / V. R. Mikryakov. Rybinsk: IBVV RAN, 1991. 153 s.

5. Zhiteneva L. D. Ekologo-gematologicheskie harakteristiki nekotoryh vidov ryb. Spravochnik / L. D. Zhiteneva, O. A. Rudnickaya, T. I. Kalyuzhnaya. Rostov n/D, 1997. 149 s.

6. Akhtar M. S. Thermal tolerance, oxygen consumption and haemato-biochemical variables of Tor putitora juveniles acclimated to five temperatures / M. S. Akhtar, A. K. Pal, N. P. Sahu, A. Ciji, P. C. Mahanta // Fish. Physiol. Biochem. 2013. Vol. 39, no. 6. P. 1387-1398.

7. Beitinger T. L. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature / T. L. Beitinger, W. A. Bennet, R. W. McCauley // Environ. Biol. Fish. 2000. Vol. 58, no. 3. P. 237-275.

8. Golovanov V. K. Temperaturnye kriterii zhiznedeyatel'nosti presnovodnyh ryb / V. K. Golovanov. M.: Poligraf-Plyus, 2013. 300 s.

9. Golovanov V. K. Ekologo-fiziologicheskie zakonomernosti raspredeleniya i povedeniya presnovodnyh ryb v termogradientnyh usloviyah / V. K. Golovanov // Vopr. ihtiologii. 2013. T. 53, № 3. S. 286-314.

10. Kapshay D. S. Verhnyaya letal'naya temperatura u molodi teplolyubivyh vidov ryb v zavisimosti ot temperatury akklimacii / D. S. Kapshay, V. K. Golovanov // Tr. Karel. NC RAN. Ser.: Eksperimental'naya biologiya. 2013. № 3. S. 185-189.

11. Golovanov V. K. Sravnitel'nyy analiz temperaturnogo optimuma i verhney temperaturnoy granicy zhiznedeyatel'nosti u molodi ryb, obitayuschih v vodoemah Verhney Volgi / V. K. Golovanov, D. S. Kapshay // Fiziologiya i biohimiya vodnyh zhivotnyh. Yaroslavl': Kancler, 2015. C. 80-90.

12. Mazur O. E. Nekotorye pokazateli krovi sibirskoy plotvy Rutilus rutilus v zone vliyaniya teplyh vod Gusinoozerskoy GRES (Vostochnaya Sibir') / O. E. Mazur // Izv. RAN. Ser. biol. 2015. № 6. S. 668-672.

13. Zhiteneva L. D. Ihtiogematologiya / L. D. Zhiteneva, O. A. Rudnickaya, T. I. Kalyuzhnaya. Rostov n/D, 2004. 256 s.

14. Ivanova N. T. Atlas kletok krovi ryb. Sravnitel'naya morfologiya i klassifikaciya formennyh elementov krovi ryb / N. T. Ivanova. M.: Legkaya i pisch. prom-st', 1983. 110 s.

15. Anitha B. Genotoxicity evaluation of heat shock in gold fish (Carassius auratus) / B. Anitha, N. Chandra, P. M. Gopinath, G. Durairaj // Mutat. Res. Genet. Toxicol. and Environ. Mutagen. 2000. Vol. 469, no 1. P. 1-8.

16. Mikryakov V. R. Reakciya immunnoy sistemy ryb na zagryaznenie vody toksikantami i zakislenie sredy / V. R. Mikryakov, L. V. Balabanova, E. A. Zabotkina, Laterova T. B., Popov A. V. M.: Nauka, 2001. 126 s.


Login or Create
* Forgot password?