Россия
Россия
Россия
Россия
Россия
аспирант с 01.01.2020 по 01.01.2023
Россия
В настоящее время в связи с интенсивным развитием аквакультуры повысился интерес к изучению иммунной системы и иммунного ответа у рыб. При выращивании рыб в аквакультуре условия их содержания должны способствовать поддержанию оптимальной активности врожденного иммунитета. Установлено, что иммунитет рыб в большей степени зависит от внешних воздействий, и условия среды обитания представляют собой активные регуляторы иммунореактивности рыб. В настоящее время для повышения и регуляции иммунного гомеостаза рыб в аквакультуре нашли широкое применение различные пробиотические препараты, обладающие способностью корригировать микробиологические и иммунные показатели за счет действия симбионтных микроорганизмов. Представлены сведения о проведении экспериментальных исследований по оценке влияния пробиотического препарата «Экофлор», иммобилизованного на энтеросорбенте, на уровень бактерицидной активности сыворотки крови, количество иммунодефицитных особей, содержание неспецифических иммунных комплексов в сыворотке крови и иммунокомпетентных органах, а также на уровень С-реактивного белка годовиков стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758). Отмечено, что использование пробиотического препарата в экспе-риментальной дозировке 6 г/кг комбикорма оказывает влияние на показатели неспецифического гуморального иммунитета. Так, стерлядь, выращенная на комбикормах с указанной нормой ввода препарата, характеризуется повышенным уровнем бактерицидной активности сыворотки крови – 98 % – и отсутствием иммунодефицитных особей – 0 %. Кроме того, данная дозировка способствует снижению концентрации неспецифических иммунных комплексов в сыворотке крови до 2,25 ± 1,65 и иммунокомпетентных органах годовиков стерляди: в печени и селезенке до 0,06 ± 0,02 и 0,30 ± 0,30 соответственно. Результаты анализа уровня С-реактивного белка указывают на то, что данный препарат не вызывает воспалительных реакций в организме рыб.
аквакультура, стерлядь, пробиотический препарат, энтеросорбент, бактерицидная активность сыворотки крови, иммунодефицитные особи, иммунные комплексы, С-реактивный белок
Введение
Известно, что нормальная микрофлора пищеварительного канала играет важную роль в поддержании здоровья организма хозяина, принимая активное участие в различных метаболических процессах, а также в формировании и функционировании иммунной системы и в обеспечении противоинфекционной защиты [1]. В последние годы накоплено большое количество данных о роли микробиоты желудочно-кишечного тракта в функционировании иммунной системы и поддержании иммунного гомеостаза, однако по-прежнему вопрос о возможности использования различных пробиотических препаратов для модуляции иммунного ответа является актуальным. Пробиотики различного состава и разных производителей отличаются как пробиотическим, так и иммунотропным эффектом. Между их способностью восстанавливать расстройства микробиоты и их иммуномодулирующей активностью не всегда существует прямая связь.
В состав ряда пробиотиков, кроме симбионтных бактерий, могут входить и дополнительные вещества, в частности энтеросорбенты, в комплексе влияющие в той или иной степени на иммунный ответ. Также эффективность сорбированных пробиотиков обусловлена формой их выпуска, способствующей обеспечению высокой биодоступности и доставке входящих в их состав пробиотических бактерий живыми и в достаточном количестве в необходимые отделы кишечника. В связи с этим использование иммобилизованных форм пробиотических препаратов в условиях индустриальной аквакультуры с целью повышения иммунного статуса рыб является актуальным.
Цель исследований – оценить влияние иммобилизованной формы пробиотического препарата «Экофлор» на показатели неспецифического гуморального иммунитета годовиков стерляди.
Материал и методы исследований
Экспериментальные работы проводились на базе лаборатории иммунологии Института биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина Российской академии наук. В качестве объектов исследований выступили годовики стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758) средней массой 84,0 ± 1,76 г.
Для проведения исследований использовали пробиотический препарат «Экофлор», представляющий собой консорциум штаммов лакто- и бифидобактерий: В. bifidum, B. longum и L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, иммобилизованных на углерод-минеральном сорбенте СУМС-1.
Исследуемые рыбы были разделены на группы: контрольную и 3 опытных. Стерлядь контрольной группы выращивалась с применением продукционных кормов фирмы Coppens, первой опытной группы – с добавлением в корм пробиотика-энтеросорбента «Экофлор» в дозировке 2 г/кг комбикорма, во второй и третьей группах дозировка пробиотика-энтеросорбента «Экофлор» составляла 4 и 6 г/кг соответственно. Продолжительность эксперимента составила 30 суток. Отбор проб проводили перед началом эксперимента, на 7-е и 14-е сут, а также в конце эксперимента. Для проведения исследований кровь у осетровых рыб отбирали методом отсечения хвостового стебля.
Для оценки влияния пробиотического препарата на энтеросорбенте на неспецифический гуморальный иммунитет осетровых рыб в сыворотке крови исследовали бактерицидную активность (БАСК), количество иммунодефицитных особей (ИМД), содержание неспецифических иммунных комплексов (ИК), уровень С-реактивного белка (СРБ). Бактерицидную активность определяли с помощью фотонефелометрического колориметрирования согласно методике, описанной О. В. Смирновой и Т. А. Кузьминой в [2] и адаптированной для рыб в [3, 4]. В зависимости от уровня БАСК выявляли долю ИМД особей, сыворотка крови которых не угнетала развитие тест-микробов. Содержание ИК устанавливали спектрофотометрически при длине волны 450 нм методом селективной преципитации с 4 % полиэтиленгликолем молекулярной массой 6 000 [5]. Уровень СРБ определяли визуально по реакции агглютинации латекс-реагента с сывороткой крови, используя набор реагентов «СРБ-Ольвекс».
Статистическую обработку результатов исследований проводили согласно общепринятым методам математической обработки c использованием элементов статистического анализа.
Результаты исследований
При иммунологических исследованиях в аквакультуре важную роль играет определение БАСК. Бактерицидная активность сыворотки крови представляет собой интегральный показатель функционального состояния врожденных факторов гуморального иммунитета: систем комплемента, лизоцима, иммуноглобулинов, противомикробных пептидов, лектинов, преципитинов, β-лизина, пропердина, дефензина и др. [1, 3, 4, 6–8]. В настоящее время в аквакультуре БАСК применяется для оценки последствий влияния токсических и паразитарных агентов на естественную резистентность и иммунный статус рыб [9].
По результатам проведенных исследований установлено, что применение пробиотического препарата на энтеросорбенте «Экофлор» способствовало изменению уровня БАСК в период выращивания (рис. 1).
Рис. 1. Уровень БАСК в сыворотке крови годовиков стерляди,
выращенной с использованием пробиотического препарата
Fig. 1. BABS level in the blood serum of sterlet yearlings grown using a probiotic preparation
Перед началом экспериментальных работ БАСК годовиков стерляди составляла 97 %. На 7-е сут экспериментального выращивания в контроле во второй (4 г/кг) и третьей (6 г/кг) опытных группах данный показатель фактически остался неизменным и оставался на достаточно высоком уровне – 98 % при полном отсутствии ИМД особей (табл. 1).
Таблица 1
Table 1
Количество ИМД особей при выращивании стерляди с использованием пробиотика
The number of immunodeficient species in growing sterlet fed with a probiotic
|
Время эксперимента |
Количество ИМД особей, %, по группам |
|||
|
контрольная |
опытная 1 |
опытная 2 |
опытная 3 |
|
|
Перед опытом |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Через 7 сут |
0 |
40 |
0 |
0 |
|
Через 14 сут |
60 |
100 |
60 |
0 |
|
Через 30 сут |
0 |
0 |
0 |
0 |
Стерлядь первой опытной группы, потреблявшая пробиотический препарат «Экофлор» в дозировке 2 г/кг комбикорма, характеризовалась снижением уровня БАСК до 60 %, при этом количество ИМД особей увеличилось до 40 %.
Через 14 сут выращивания обнаружено, что БАСК рыб первой опытной группы составила 0 % при возросшем уровне ИМД особей до 100 %. В контрольной и во второй опытной группах БАСК не превышала 30 %, в то время как уровень ИМД особей вырос до 60 %. В третьей опытной группе БАСК снизилась на 18 %, а количество ИМД особей осталось на прежнем уровне. В конце экспериментальных работ уровень БАСК во всех группах выращивания вырос до 97–98 %, а количество ИМД особей снизилось до 0 %.
Таким образом, по результатам проведенных иммунологических исследований установлено, что основные изменения уровня БАСК произошли на 14-е сут после начала экспериментального кормления. Наиболее значимое снижение данного показателя зафиксировано у годовиков стерляди второй опытной группы, получавших пробиотический препарат «Экофлор» в количестве 4 г/кг комбикорма. Однако необходимо отметить, что на протяжении всего периода экспериментальных исследований высокий уровень БАСК и отсутствие ИМД особей отмечен только у рыб третьей опытной группы, получавшей пробиотический препарат в количестве 6 г/кг комбикорма, что указывает на положительное влияние данной дозировки на неспецифический гуморальный иммунитет.
Известно, что неспецифические иммунные комплексы – это комплексы «антиген – антитело» и связанные с ними компоненты комплемента, образующиеся в результате взаимодействия с низкомолекулярными чужеродными соединениями (гаптенами, растворимыми антигенами и аутоантигенами). Они играют важную роль в процессах регуляции иммунных реакций, элиминации ксенобиотиков из организма и поддержании иммунологического и биохимического гомеостаза. Клетки крови с помощью компонентов комплемента связывают растворимые ИК и доставляют к макрофагам иммунокомпетентных органов, обеспечивая клиренс крови от ИК. При насыщении организма чужеродными телами происходит избыточное образование ИК вследствие супрессии клиринговой функции клеток фагоцитарной системы [1, 10]. Нарушение этого механизма наблюдается при инфекционных, инвазионных, токсических и аутоиммунных болезнях.
При исследовании содержания неспецифических ИК в сыворотке крови и иммунокомпетентных органах стерляди обнаружены отличия как в разные сроки отбора проб, так и между различными группами рыб, а также тканями и органами.
При изучении уровня ИК в сыворотке крови годовиков стерляди установлено, что в течение первых двух недель экспериментальных работ значимых отличий между различными группами рыб не зафиксировано (рис. 2).
В конце выращивания у стерляди контрольной группы данный показатель значительно увеличился как по сравнению с опытными группами, так и по сравнению с данными до начала эксперимента.
В результате анализа уровня ИК в тканях печени годовиков стерляди обнаружен наиболее высокий уровень неспецифических ИК (рис. 3).
Рис. 2. Уровень неспецифических иммунных комплексов в сыворотке крови стерляди
Fig. 2. Level of nonspecific immune complexes in the sterlet blood serum
Рис. 3. Уровень неспецифических иммунных комплексов в печени стерляди
Fig. 3. Level of nonspecific immune complexes in the sterlet liver
Через неделю исследований у стерляди первой опытной группы содержание ИК было значительно выше, чем в других вариантах выращивания, и составило 45,80 ± 14,85. На 14-е сут произошло повышение показателей ИК до 45,27 ± 9,97 во второй опытной группе, выращиваемой с использованием пробиотика в дозировке 4 г/кг комбикорма, что на 66,1 % выше, чем в контрольном варианте выращивания. В конце экспериментальных исследований в третьей опытной группе (при использовании дозировки 6 г/кг) происходит снижение уровня ИК до 0,06 ± 0,02.
При изучении влияния пробиотика-энтеросорбента «Экофлор» на уровень ИК в почках годовиков стерляди обнаружено, что в течение всего периода экспериментальных работ данный показатель не претерпевал значительных колебаний и находился в стабильном состоянии (рис. 4).
Установлено, что изменение данного показателя сходно с данными сыворотки крови: отсутствие значимых отличий в первые 14 сут выращивания и более высокий уровень в контрольной группе в конце эксперимента.
Рис. 4. Уровень неспецифических иммунных комплексов в почках стерляди
Fig. 4. Level of nonspecific immune complexes in the sterlet kidneys
Изучение уровня неспецифических ИК в селезенке стерляди в период выращивания позволило установить, что на 7-е сут произошло повышение данного показателя в третьей опытной группе (6 г/кг) до 3,30 ± 1,62, в то время как в контроле и других опытах показатель не превышал 1,16 ± 0,55 (рис. 5).
Рис. 5. Уровень неспецифических иммунных комплексов в селезенке стерляди
Fig. 5. Level of nonspecific immune complexes in the sterlet spleen
Достоверные отличия были зафиксированы только на 14-е сут эксперимента. Так, показатель ИК в третьей опытной группе стабилизировался и снизился до 0,56 ± 0,12, в то время как контроль характеризовался повышенным значением данного показателя и составил 3,93 ± 1,67.
Таким образом, установлено, что более низкие показатели уровня ИК в тканях и органах были характерны для стерляди опытной группы, в корм которой добавляли препарат «Экофлор» в дозировке 6 г/кг. Полученные данные хорошо согласуются с высокими показателями БАСК.
Не менее важным показателем, отражающим уровень неспецифического гуморального иммунитета рыб, является СРБ. Данный показатель является белком острой фазы, наиболее чувствительным лабораторным маркером инфекции, воспаления и тканевого повреждения, уровень которого повышается при воспалительных процессах в организме.
В период проведенных исследований у большинства рыб всех групп выращивания перед началом опытных работ был зафиксирован отрицательный уровень СРБ (менее 6 мг/л) (табл. 2).
Таблица 2
Table 2
Уровень С-реактивного белка годовиков стерляди, выращенной
с использованием пробиотического препарата
Level of C-reactive protein of sterlet yearlings grown using a probiotic preparation
|
Время эксперимента |
Уровень СРБ, мг/л, по группам |
|||
|
контрольная |
опытная 1 |
опытная 2 |
опытная 3 |
|
|
Перед опытом |
˂ 6 |
˂ 6 |
˂ 6 |
˂ 6 |
|
Через 7 сут |
˂ 6 |
˂ 6 |
˂ 6 |
˂ 6 |
|
Через 14 сут |
˂ 6 |
˂ 6 |
˂ 6 |
˂ 6 |
|
Через 30 сут |
˂ 6 |
˂ 6 |
6 |
6 |
Необходимо отметить, что на 7- и 14-е сут экспериментальных исследований во всех группах уровень СРБ остался на прежнем уровне. На 30-е сут выращивания в контрольной и в первой опытной группах зафиксирован отрицательный уровень СРБ (менее 6 мг/л). Слабоположительный уровень (более 6 мг/л) отмечен только у особей из 2 и 3 опытных групп в конце наблюдений. Полученные данные указывают на то, что данный препарат не вызывал воспалительную реакцию в организме стерляди.
Заключение
По результатам проведенных исследований установлено, что применение пробиотика-энтеросорбента «Экофлор» в составе комбикормов для осетровых рыб оказывает влияние на показатели неспецифического гуморального иммунитета. Характер влияния различается в зависимости от дозировки препарата. Положительный эффект зафиксирован в опытной группе, потреблявшей комбикорм с препаратом «Экофлор» в дозировке 6 г/кг комбикорма. У данной группы стерляди наблюдались наиболее высокие показатели бактерицидной активности сыворотки крови и отсутствие иммунодефицитных особей на низкий уровень неспецифических иммунных комплексов в сыворотке крови и иммунокомпетентных органах. В группах рыб, получавших более низкую дозировку препарата, отмечено снижение уровня БАСК и наличие ИМД особей, а также более высокий уровень содержания ИК.
1. Койхо Р., Саншайн Д., Бенджамини Э. Иммунология: учеб. пособие. М.: Академия, 2008. 368 с.
2. Смирнова О. В., Кузьмина Т. А. Определение бактерицидной активности сыворотки методом нефелометрии // Журн. микробиологии. 1966. № 4. С. 8-11.
3. Микряков В. Р. Закономерности функционирования иммунной системы пресноводных рыб: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М.: Изд-во ИЭМиЭЖ АН СССР, 1984. 37 с.
4. Микряков В. Р. Закономерности формирования приобретенного иммунитета у рыб. Рыбинск: Изд-во ИБВВ РАН, 1991.154 c.
5. Гриневич Ю. А., Алферов А. Н. Определение иммунных комплексов в крови онкологических больных // Лабораторное дело. 1981. № 8. С. 493-496.
6. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. 592 с.
7. Campoverde C., Milne D. J., Estévez A., Duncan N., Secombes C. J., Andree K. B. Ontogeny and modulation after PAMPs stimulation of β-defensin, hepcidin, and piscidin antimicrobial peptides in meagre (Argyrosomus regius) // Fish & Shellfish Immunology. 2017. V. 69. P. 200-210.
8. Van der Marel M. C. Carp mucus and its role in mu-cosal defense: PhD Thesis, Wageningen University. The Netherlands. 2012. 189 p.
9. Суворова Т. А., Силкина Н. И. Влияние антибактериального и пробиотического препаратов на специфический и неспецифический иммунитет и окислительные процессы в организме рыб // Тр. ИБВВ РАН. 2019. Вып. 87 (90). С. 62-70.
10. Логинов С. И., Смирнов П. Н., Трунов А. Н. Иммунные комплексы у животных и человека: норма и патология. Новосибирск: Изд-во РАСХН. Сиб. отд. ИЭВС и ДВ, 1999. 144 с.
