Текст (PDF):
Читать
Скачать
Введение
В настоящее время общепризнанным фактом является то, что эффективность производства продукции аквакультуры во многом зависит от способов использования разнообразных генетических ресурсов. Эффективные технологии воспроизводства рыбных запасов должны быть разработаны на основе изучения генетической и эпигенетической регуляции таких важных признаков аквакультуры, как устойчивость к болезням и стрессам, скорость роста, урожайность, репродуктивные характеристики, поведение. Активно обсуждаются возможности использования геномики, протеомики и транскриптомики в повышении эффективности аквакультуры [1].
Большое внимание привлекает использование эпигенетических факторов в аквакультуре: показано влияние эпигенетических факторов на повышение продуктивности, регуляцию соотношения полов, мышечную массу личинок, качество спермы у рыб [2–6]; отмечена роль эпигенетических факто-ров
в формировании сердечно-сосудистой, мышечной, неврологической систем у личинок рыб [7]; рассматриваются варианты программирования питания с помощью измененного рациона у маточного стада леща и его влияние на качество икры, рост и развитие потомства [8]. Однако наряду с этими подходами высокоэффективными могут быть и ненаследственные способы увеличения важнейших характеристик аквакультуры: продуктивности и устойчивости рыб – через фенотипическую активацию с использованием генетически активных веществ. Среди многочисленных групп биологически активных соединений выделяется группа генетически актив-ных веществ, усиливающих процессы репарации (восстановления) – репарагенов. Среди известных репарагенов наибольшее внимание уже давно при-влекает парааминобензойная кислота (ПАБК). По сравнению с другими генетически активными веществами ПАБК не образует валентных связей с генетическим субстратом и ферментами и, тем не менее, усиливает переход генетического материала в сторону возросшей репарации [9, 10]. Известно, что ПАБК повышает устойчивость к болезням, увеличивает продуктивность растений, влияет на жизнеспособность рыб на ранних стадиях развития, увеличивает противовоспалительную активность; стимулирует выработку интерферона у мышей, влияет на газообмен и температуру тела у крыс-альбиносов, влияет на процессы апоптоза конъюнктивы и эпителия роговицы взрослых крыс in vivo после гипобарической гипоксии, стимулирует рост и развитие кур [11–20]. В исследованиях, проведенных на двух видах сиговых рыб рода Coregonus – пыжьяне С. lavaretus pidschian (Gmelin) и пеляди С. peled (Gmelin), – была показана способность ПАБК стабилизировать развитие зародышей, полученных из икры низкого качества [16]. В основе этого процесса лежит способность ПАБК образовывать комплексы с широким набором ферментов, увеличивая объем ферментативной репарации [9, 10]. В ранних работах была показана способность ПАБК влиять на дисконъюгацию
и спирализацию хромосом, образовывать комплексы с хромосомами, блокируя возникновение хромосомных перестроек [21].
Возможность фенотипической коррекции эмбриогенеза с помощью ПАБК является интересной задачей, которую лучше всего решать, используя такой объект, как чир (Сoregonus nasus (Pallas,1776)), который среди разных видов сиговых рыб отличается генетической нестабильно-стью в период эмбрионального развития [22–24].
Целью настоящей работы является изучение способности ПАБК влиять на жизнеспособность чира (Сoregonus nasus (Pallas, 1776)) на ранних стадиях онтогенеза.
Задачи:
1. Изучить ПАБК в качестве фактора повышения жизнеспособности и скорости роста чира на ранних стадиях развития.
2. Оценить способность ПАБК к уменьшению частоты спонтанных хромосомных нарушений
у чира в период эмбриогенеза.
Материал и методика
Экспериментальные работы по воздействию ПАБК на рыб проводили с октября по июнь
2014–2018 гг. Объектом исследований служил чир (Coregonus nasus (Pallas, 1776)). Половозрелых рыб отлавливали в районе их нерестилищ (р. Ляпин, 63°39´53´´с. ш., 64°14´26´´ в. д.), сбор половых продуктов осуществляли от текучих производителей. Партии икры, собранной от нескольких самок, осе-меняли спермой нескольких самцов и тщательно перемешивали. Опыты с чиром были заложены на
р. Ляпин во время промышленной заготовки икры сиговых рыб и затем переведены на Тобольский рыбоводный завод (г. Тобольск Тюменской области).
Было осуществлено 2 постановки опытов: 2 и 4 ч воздействия, в каждой постановке по 2 производственных серии (повторы для получения статистически достоверного результата), использовалась икра разных самок.
Первые серии опытов заключались в том, что икру сразу же после оплодотворения делили на 8 вариантов: 7 опытных вариантов выдерживали в растворах ПАБК разной концентрации (0,01; 0,005; 0,001; 0,0005; 0,0001; 0,00005; 0,00001 %), контрольный
не обрабатывали ПАБК. Растворы ПАБК готовили на теплом физиологическом растворе (70 °С) Рингера–Локка, перед употреблением охлаждали до температуры отцеженных половых продуктов (+1,0–+1,2 °С). Для первых двух серий опытов время обработки (экспозиция) составила 2 ч. Затем обработанную икру промывали водой и закладывали на инкубацию в аппараты Вейса. Температура воды в аппаратах за период инкубации составляла в среднем +1,2 °С. Последующие серии опытов были аналогичными, различие заключалось в том, что время обработки икры ПАБК составило 4 ч.
Личинок из контрольного и опытных вариантов высаживали в производственные проточные лотки для подращивания в количестве 2 500 шт. в каждом варианте опыта при кормлении артемиями (Artemia salina). Через 34 дня мальков подсчитывали, затем взвешивали по 50 шт. из каждого вариан-та.
Цитогенетическую обработку зародышей чира проводили по стандартной ацетоорсеиновой методике [25]. Фиксировали зародыши на стадии гаструлы в фиксаторе Карнуа. Для окрашивания препаратов использовали орсеин фирмы «Merсk» (Германия), цитогенетический анализ проводили при увеличении 10 (окуляра) × 100 (объектива)
с использованием микроскопа Axiostar plus фирмы Zeiss (Германия).
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica.
Результаты и обсуждение
Среди сиговых рыб, промышленное воспроизводство которых осуществляется заводским способом, чир отличается крайне низкой жизнеспособностью в период эмбрионального развития [26–28]. Считается, что возможная причина этого заключается в нестабильности кариотипа, что проявляется
в повышенной частоте спонтанных хромосомных нарушений у этого вида [22–24]. Отмечается резкое сокращение численности обского чира в последние 30 лет (в 6 раз) [29].
Способность ПАБК стабилизировать развитие эмбрионов пыжьяна и пеляди, полученных из икры низкого качества [16], указывает на возможность фенотипической коррекции генотипа в эмбриогенезе в направлении нормализации с помощью этого генетически активного соединения. Рыбоводная практика показывает, что отрицательные особен-ности генотипа у рыб проявляются в форме гибели эмбрионов в периоды прохождения критических стадий в развитии, когда происходят резкие преоб-разования морфогенетических функций в сторону их усложнения и расширения. У рыб таковыми являются стадии гаструляции и предличиночный этап (при вылуплении эмбрионов из оболочек).
В табл. 1 приведены результаты получения личинок чира с использованием ПАБК в различных концентрациях путем обработки оплодотворенной икры при экспозиции 2 ч.
Таблица 1
Table 1
Результаты инкубации икры чира после обработки оплодотворенной икры ПАБК
в разных концентрациях при экспозиции 2 ч
The results of incubation of broad whitefish eggs after fertilized eggs treatment with PABA
in different concentrations under 2-hour exposure
Концентрация ПАБК, % Количество
оплодотворенной икры, тыс. шт. % развивающейся икры на стадии бластулы Получено предличинок
тыс. шт. в %
от развивающейся икры
Первая серия опытов
0,01 12,43 91,2 ± 1,15 5,77 50,2 ± 0,46
0,005 16,24 92,6 ± 1,07 8,58 57,9 ± 0,37*
0,001 17,82 95,5 ± 0,84 10,01 59,2 ± 0,34*
0,0005 17,36 93,3 ± 1,02 11,20 69,1 ± 0,30*
0,0001 18,44 96,1 ± 0,79* 11,24 63,4 ± 0,32*
Окончание табл. 1
End of table 1
Концентрация ПАБК, % Количество
оплодотворенной икры, тыс. шт. % развивающейся икры на стадии бластулы Получено предличинок
тыс. шт. в %
от развивающейся икры
Первая серия опытов
0,00005 17,63 93,3 ± 1,02 11,24 68,3 ± 0,31*
0,00001 18,05 94,4 ± 0,93 11,28 66,2 ± 0,31*
Контроль 23,40 92,4 ± 1,08 10,58 48,9 ± 0,34
Вторая серия опытов
0,005 11,50 93,4 ± 1,02 6,77 63,2 ± 0,41*
0,001 16,16 95,1 ± 0,88 11,55 75,1 ± 0,28*
0,0005 16,66 94,9 ± 0,89 12,70 80,3 ± 0,25*
0,0001 17,99 96,3 ± 0,77 13,72 79,2 ± 0,24*
0,00005 14,22 96,3 ± 0,77 11,94 84,6 ± 0,23*
0,00001 18,05 96,2 ± 0,78 14,47 80,1 ± 0,23*
Контроль 75,86 95,1 ± 0,88 43,57 57,4 ± 0,17
* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,01.
Из анализа данных следует, что в двух сериях опытов процент развивающихся зародышей на стадии бластулы был высоким. Данный факт свидетельствует о том, что пониженная эмбриональная жизнеспособность не является результатом пониженной оплодотворяющей способности зрелых половых продуктов, а определяется факторами, проявляющимися после прохождения зародышами стадии бластулы. Обработка оплодотворенной икры ПАБК в семи концентрациях от 0,00001 до 0,01 % при экс-позиции 2 ч положительно повлияла на жизнеспо-собность эмбрионов. Результаты в последователь-ных сериях опытов повторяются, что свидетель-ствует о достоверности данных. В контроле было заложено значительно больше оплодотворенной икры (в 7–8 раз), и выход в абсолютных значениях (тыс. шт.) выше, чем в вариантах с ПАБК, но срав-нение проводилось по относительным показателям, по выходу в %. И в первой серии опытов преимущество опытных вариантов над контрольным (по выходу предличинок в % от развивающейся икры) колебалось в среднем от 1,3 до 20,2 %, во второй серии – от 5,8 до 27,2 %. Наименьший эффект отмечен в вариантах с применением ПАБК в самой высокой концентрации – 0,01 %, поэтому ее исключили из второй серии опытов. В диапазоне концентраций от 0,005 до 0,00001 % эффективность применения ПАБК проявилась примерно в равной степени.
При увеличении экспозиции до 4 ч результаты инкубации икры чира были аналогичными (табл. 2).
Таблица 2
Table 2
Результаты инкубации икры чира после обработки оплодотворенной икры ПАБК
в разных концентрациях при экспозиции 4 ч
The results of incubation of broad whitefish eggs after fertilized eggs treatment with PABA
in different concentrations under 4-hour exposure
Концентрация ПАБК, % Количество
оплодотворенной икры, тыс. шт. % развивающейся икры на стадии бластулы Получено предличинок
тыс. шт. в %
от развивающейся икры
Первая серия опытов
0,01 8,00 84,9 ± 1,45* 3,85 56,7 ± 0,56*
0,005 11,85 94,9 ± 0,89 6,54 58,1 ± 0,43*
0,001 9,94 95,4 ± 0,85* 6,27 66,0 ± 0,42*
0,0005 11,27 94,5 ± 0,93 7,89 74,1 ± 0,35*
0,0001 9,26 94,3 ± 0,94 5,54 63,4 ± 0,45*
0,00005 20,14 95,9 ± 0,81* 11,08 57,3 ± 0,33*
0,00001 21,81 94,0 ± 0,97 12,39 60,4 ± 0,31*
Контроль
89,11 90,8 ± 1,18 41,10 50,8 ± 0,17
Вторая серия опытов
0,005 9,81 94,0 ± 0,97 5,43 58,9 ± 0,47*
0,001 17,06 95,8 ± 0,81 10,60 67,8 ± 0,32*
0,0005 17,19 93,0 ± 1,04 11,70 73,1 ± 0,29*
0,0001 17,16 93,8 ± 0,98 11,20 69,6 ± 0,30*
0,00005 17,98 94,2 ± 0,95 11,37 67,1 ± 0,31*
0,00001 17,76 95,3 ± 0,86 11,73 69,3 ± 0,30*
Контроль 79,77 95,1 ± 0,88 43,57 57,4 ± 0,17
* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,0.
В первой серии опытов преимущество опытных вариантов с ПАБК по выходу предличинок (в % от развивающейся икры) над контрольным колебалось в среднем в пределах 5,9–23,3 %, в другой серии – в пределах – 1,5–15,7 %.
Результаты подращивания личинок приведены в табл. 3 и 4.
Таблица 3
Table 3
Результаты подращивания в течение 34 дней личинок чира, полученных из икры,
обработанной ПАБК после оплодотворения при экспозиции 2 ч
The results of rearing within 34 days of broad whitefish larvae obtained
from roe treated with PABA after fertilization under 2-hour exposure
Концентрация ПАБК, % Посажено
личинок, шт. Получено мальков Масса мальков,
мг**(х ± mx)
шт. в % от личинок
Первая серия опытов
0,005 2 500 2 190 87,6 ± 0,50* 31,9 ± 0,94
0,001 2 325 93,0 ± 0,37* 35,1 ± 0,88
0,0005 2 310 92,4 ± 0,39* 35,6 ± 0,70
0,0001 2 380 95,2 ± 0,31* 35,2 ± 0,90
0,00005 2 160 86,4 ± 0,52* 39,0 ± 0,90*
0,00001 2 265 90,6 ± 0,43* 36,7 ± 0,88*
Контроль 1 902 76,1 ± 0,69 32,8 ± 1,05
Вторая серия опытов
0,005 2 500 1 600 64,0 ± 0,85 42,1 ± 1,42
0,001 1 720 68,8 ± 0,79* 52,9 ± 2,03
0,0005 1 680 67,2 ± 0,81* 52,7 ± 1,86
0,0001 1 740 69,6 ± 0,78* 58,2 ± 2,25*
0,00005 1 760 70,4 ± 0,77* 58,7 ± 2,12*
0,00001 1 610 64,4 ± 0,84* 56,1 ± 2,03
Контроль 1 530 61,2 ± 0,88 47,2 ± 1,94
* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,01; ** в каждом варианте опыта взвешено по 50 мальков.
Таблица 4
Table 4
Результаты подращивания в течение 34 дней личинок чира, полученных из икры,
обработанной ПАБК после оплодотворения при экспозиции 4 ч
The results of rearing within 34 days of broad whitefish larvae obtained from roe treated
with PABA after fertilization under 4-hour exposure
Концентрация ПАБК, % Посажено
личинок, шт. Получено мальков Средняя масса мальков, мг**(х ± mx)
шт. в % от личинок
Первая серия опытов
0,005 2 500 2 035 81,4 ± 0,61* 37,0 ± 1,09
0,001 2 065 83,4 ± 0,58* 41,6 ± 0,97*
0,0005 2 105 84,2 ± 0,56* 37,2 ± 1,11
0,0001 2 145 85,8 ± 0,53* 37,1 ± 1,14
0,00005 2 050 82,0 ± 0,60* 38,7 ± 0,96*
0,00001 1 985 79,4 ± 0,64* 34,4 ± 1,00
Контроль 1 902 76,1 ± 0,69 33,6 ± 1,27
Вторая серия опытов
0,005 2 500 1 810 72,4 ± 0,74* 52,8 ± 1,71
0,001 1 692 67,7 ± 0,80* 58,5 ± 1,75*
0,0005 1 805 72,2 ± 0,75* 55,1 ± 1,76*
0,0001 1 920 76,8 ± 0,68* 56,7 ± 1,68*
0,00005 1 881 75,2 ± 0,70 52,2 ± 1,45
0,00001 1 780 71,2 ± 0,76* 52,8 ± 1,93
Контроль 1 530 61,2 ± 0,88 48,1 ± 1,84
* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,01; ** в каждом варианте опыта взвешено по 50 мальков.
Влияние ПАБК проявилось в ранний постэмбриональный период в преимуществе по жизнеспособности подопытных мальков над контрольными. При экспозиции действия ПАБК 2 и 4 ч в опытных вариантах было получено в среднем 1,2 раза больше мальков, чем в контрольных. Положительное действие ПАБК проявилось не только в повышении жизнеспособности рыб, но и в увеличении скорости роста мальков. Как видно из табл. 3, в первой серии опытов наиболее эффективными были самые низкие концентрации ПАБК (0,00005 и 0,00001 %), при воздействии которых масса мальков оказалась выше
в 1,19–1,11 раза, чем в контрольном варианте. Во второй серии опытов максимальное увеличение массы тела в сравнении с контролем (в 1,23–1,24 раза) отмечено в вариантах с концентрациями ПАБК 0,0001 и 0,00005 %. При увеличении экспозиции до
4 ч в других вариантах опытов отмечено достоверное увеличение массы тела рыб. В первой серии опытов увеличение массы тела в 1,15–1,23 раза отмечено в вариантах с концентрациями ПАБК 0,00005 и 0,001 % соответственно, во второй серии опытов – в трех вариантах – 0,001, 0,0005 и 0,0001 % – отмечено увеличение массы в сравнении с контролем в 1,20; 1,14 и 1,17 раз соответственно.
Цитогенетический анализ зародышей чира на стадии гаструлы выявил снижение частоты хромосомных перестроек во всех вариантах с ПАБК при экспозиции 2 и 4 ч (табл. 5).
Таблица 5
Table 5
Встречаемость клеток с хромосомными нарушениями у зародышей чира на стадии гаструлы
в опытах с воздействием ПАБК на оплодотворенную икру
Occurrence of cells with chromosomal abnormalities in broad whitefish embryos at the gastrula
stage in experiments with PABA treatment of fertilized eggs
Концентрация ПАБК, % Просмотрено
зародышей, шт. Количество просмотренных клеток, шт. Средняя частота аномальных митозов на один зародыш, %
Экспозиция 2 ч
0,005 20 2 766 10,22 ± 0,48*
0,001 21 3 180 10,98 ± 0,30*
0,0005 20 2 920 12,09 ± 0,37*
0,0001 18 2 730 10,47 ± 0,34*
0,00005 16 2 434 9,27 ± 0,35*
0,00001 18 2 389 9,94 ± 0,44*
Экспозиция 4 ч
0,005 20 3 734 19,58 ± 0,55*
0,001 20 3 340 14,96 ± 0,34*
0,0005 20 3 136 14,69 ± 0,40*
0,0001 16 2 474 18,87 ± 0,41*
0,00005 18 2 805 18,77 ± 0,54*
0,00001 16 2 370 19,92 ± 0,51*
Контроль 20 3 112 29,25 ± 1,04
* Различие с контролем статистически достоверно на уровне р ˂ 0,01.
При экспозиции 2 ч наибольший эффект ПАБК был отмечен в варианте с 0,00005 % концентрацией ПАБК, при экспозиции 4 ч – при концентрации 0,0005 %. Не было выявлено зависимости цитогенетического эффекта ПАБК от ее концентрации и длительности обработки икры (экс-позиции). Воздействие ПАБК на зародышевые клетки чира приводит к снижению частоты хро-мосомных нарушений в 1,5–2 раза сравнении
с контролем.
Проведенные исследования свидетельствуют об эффективности предложенного подхода – увеличении важнейших характеристик аквакультуры – жизнеспособности и продуктивности – через фенотипическую активацию с использованием генетически активного вещества – ПАБК. Известно, что данное соединение обладает высокой моди-фикационной способностью, высоким потенциа-лом взаимодействия с хромосомами и ферментами, с которыми ПАБК связывается и активизирует про-цессы репарации [9, 10, 12, 20, 30]. Так как объектом взаимодействия ПАБК в репарагенезе является генетический материал, становится по-нятной способность ПАБК эффективно восста-навливать хромосомные нарушения и оказывать положительное влияние на жизнеспособность
и скорость роста чира на ранних стадиях развития.
Выводы
1. Использование малых концентраций ПАБК повышает выживаемость чира на ранних стадиях развития. Обработка оплодотворенной икры растворами ПАБК позволяет увеличить скорость роста чира в ранний постэмбриональный период. Максимальный эффект отмечен при использовании концентраций ПАБК 0,00005 и 0,0001 %.
2. Обработка икры ПАБК уменьшает частоту хромосомных нарушений на стадии гаструлы
у чира, повышая генетическую стабильность рыб
в эмбриональный период.
