ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ И PH НА УРОВЕНЬ АКТИВНОСТИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ ЛЕНСКОГО ОСЕТРА (ACIPENSER BAERII)
Аннотация и ключевые слова
Аннотация (русский):
Исследованы адаптации ферментов слизистой оболочки кишечника ленского осетра к факторам среды обитания (температура и рН). Показано, что температурный оптимум для щелочной фосфатазы находится в диапазоне значений температуры 60–65 °С, для α-амилазы – 30 °С, для мальтазы – 55 °С, для казеинлитических протеиназ – 40 °С. Показано, что исследованные ферменты ленского осетра сохраняют достаточно высокую относительную активность при низких значениях (0 °С) температуры инкубации. Максимальная активность α-амилазы, мальтазы, щелочной фосфатазы обнаружена при рН 8–9, 7, 8–9 и 9–10 соответственно, для казеинлитических протеиназ оптимальное значение рН находится в диапазоне 8–10. Данные оптимумы рН соответствуют таковым для рыб Волжского бассейна. Ленский осетр обитает в более низких температурных условиях, нежели представители Волжского бассейна, скорее всего, с этим связано смещение температурных оптимумов α-амилазы и казеинлитических протеиназ в сторону более низких значений температуры. Кроме того, отмечается сходство ответных реакций пищеварительных ферментов на изменение температуры инкубации у ленского осетра и рыб, обитающих в арктических широтах. Подтверждено, что температурные адаптации пищеварительной системы пойкилотермных организмов реализуются главным образом благодаря перестройкам ферментных систем.

Ключевые слова:
ленский осетр, пищеварительные ферменты, кишечный эпителий, адаптация, температура, рН
Текст
Текст произведения (PDF): Читать Скачать

Введение Механизмы действия различных факторов на пищеварительные процессы достаточно подробно изучены у высших позвоночных животных, а также у некоторых видов рыб [1–4]. В то же время работ, посвященных изучению влияния этих факторов на пищеварительные ферменты осетровых видов рыб, мало [4–6]. Следует отметить, что наибольший интерес представляет изучение влияния температуры и рН – одних из основных абиотических факторов среды, которые определяют целый ряд параметров жизнедеятельности рыб, такие как скорость протекания метаболических процессов, интенсивность питания, скорость усвоения пищи, а также влияют на различные характеристики ферментов. В связи с этим целью исследований явилось изучение влияния различных значений температуры и рН инкубации на уровень активности некоторых пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника у представителя сем. Acipenseridae – ленского осетра. Материал и методика исследований Нами были исследованы годовики ленского осетра (Acipenser baerii), выращенные в искусственных условиях. Было исследовано 36 экз. Пойманных рыб в специальных ёмкостях в течение 1–2 часов доставляли в лабораторию, где у них на холоде изымали желудочно-кишечный тракт и специальным скребком снимали слизистую оболочку кишечника. Гомогенаты готовили при помощи гомогенизатора (лабораторный гомогенизатор Daihan Scientiic), добавляя охлажденный до 2–4 °С раствор Рингера для холоднокровных животных (109 мМ NaCl, 1,9 мМ KCl, 1,1 мМ CaCl2, 1,2 мМ NaHCO3) в соотношении 1 : 49. При исследовании влияния температуры содержимое пробирок инкубировали в диапазоне 0–70 °С для щелочной фосфатазы, мальтазы и казеинлитических протеиназ и 0–60 °С – для α-амилазы (при рН 7,4). Определение влияния рН проводили в диапазоне 3–12, при температуре инкубации 25 °С. Уровень активности α-амилазы (КФ 3.1.1.1) определяли по убыли крахмала модифицированным методом Смита и Роя, уровень активности мальтазы (КФ 3.2.1.20) – модифицированным глюкозооксидазным методом, щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) – по степени гидролиза n-нитро-фенилфосфата Na. Казеинлитическую активность протеиназ (КФ 3.4.21) определяли модифицированным методом Ансона [7]. В качестве субстратов использованы: для α-амилазы – 0,1 %-й раствор крахмала; для мальтазы – 2 %-й раствор мальтозы; для щелочной фосфатазы – 0,6 мМ раствор n-нитро-фенилфосфата Na, приготовленный на растворе Рингера; для казеинлитических протеиназ – 1 %-й раствор казеина, приготовленный на фосфатном буфере (1/15 M Na2HPO4 · 2H2O и 1/15 M KH2PO4 в соотношении 4 : 1). Активность ферментов выражали в мг или мкмоль продукта гидролиза, образующегося за 1 минуту инкубации в расчёте на 1 г влажной массы слизистой. Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методикам [8]. Данные обрабатывали с использованием приложения EXEL программы MS Office для WINDOWS XP. Результаты исследования Результаты влияния температуры инкубации на уровень активности ферментов слизистой оболочки кишечника ленского осетра представлены в табл. 1. Таблица 1 Влияние температуры инкубации на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника ленского осетра, мкмоль/(г·мин) Т, ºСα-Амилаза*МальтазаЩелочная фосфатазаКазеинлитические протеиназы 011,95 ± 0,183,76 ± 0,180,72 ± 0,022,31 ± 0,19 1013,08 ± 0,176,43 ± 0,230,82 ± 0,024,79 ± 0,19 2013,43 ± 0,1811,37 ± 0,081,17 ± 0,019,45 ± 0,13 2514,65 ± 0,26 –– 3014,91 ± 0,0914,53 ± 0,191,82 ± 0,0115,94 ± 0,21 4013,17 ± 0,1715,13 ± 0,083,27 ± 0,0117,07 ± 0,19 5012,30 ± 0,2615,28 ± 0,084,14 ± 0,0115,80 ± 0,17 55–16,44 ± 0,234,27 ± 0,06– 605,93 ± 0,2615,52 ± 0,154,53 ± 0,0715,19 ± 0,30 65––4,52 ± 0,15– 70–7,92 ± 0,262,74 ± 0,134,32 ± 0,17 * мг/(г·мин). Как видно из табл. 1, температурный оптимум щелочной фосфатазы ленского осетра составляет 60–65 °С, что соответствует полученным ранее данным для представителей других экологических групп. Так, температурный оптимум данного фермента слизистой оболочки кишечника скумбрии, ставриды и сардинеллы соответствует 50–50 °С [9]. Высокие значения температурного оптимума щелочной фосфатазы отмечены и у представителей Волжского бассейна. Так, например, у судака, окуня, карпа, карася оптимум фермента равен 50 °С [2]. Отмечено также, что при 0 °С активность щелочной фосфатазы составляет 92 % у судака и 88 % у леща от максимальной активности, принятой за 100 % [2], в то время как у ленского осетра активность данного фермента при температуре 0 °С составляет лишь 16 % от максимальной. Аналогичная закономерность была обнаружена ранее для кеты [10]. Низкие значения температурного оптимума отмечены для α-амилазы слизистой оболочки кишечника ленского осетра – 30 °С. Температурный оптимум данного фермента у рыб, обитающих в Волго-Каспийском бассейне, обнаруживается, как правило, при 40 °С [11]. Следует отметить, что данное значение температурного оптимума соответствует таковому для рыб, обитающих в северных широтах [10]. Несмотря на низкие значения температурного оптимума, у ленского осетра активность при температуре 0 °С достаточно высока и составляет 80 % от максимального значения, в то время как у большинства пресноводных костистых рыб – лишь 15 % [2]. Температурный оптимум мальтазы у ленского осетра соответствует таковому для рыб Волго-Каспийского бассейна и составляет 55 °С. Относительная активность мальтазы при температуре инкубации 0 °С составляет 23 %, что соотносится с температурной характеристикой рыб Волго-Каспийского бассейна [3]. Достаточно низкие значения температурного оптимума (40 °С) отмечены при исследовании уровня активности казеинлитических протеиназ. Относительная активность данного фермента при температуре 0 °С у ленского осетра намного ниже, чем у костистых видов рыб Волжского бассейна и составляет соответственно 13 и 35–70 % от максимума. В табл. 2 представлены данные по влиянию рН инкубационной среды на уровень активности ферментов слизистой оболочки кишечника ленского осетра. Таблица 2 Влияние рН инкубации на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника ленского осетра, мкмоль/(г·мин) рНα-Амилаза*МальтазаЩелочная фосфатазаКазеинлитические протеиназы 38,02 ± 0,291,01 ± 0,080,36 ± 0,01– 49,10 ± 0,282,37 ± 0,080,38 ± 0,01– 510,43 ± 0,373,92 ± 0,080,38 ± 0,01– 612,34 ± 0,1110,01 ± 0,110,42 ± 0,014,46 ± 0,10 717,77 ± 0,2912,88 ± 0,880,48 ± 0,019,78 ± 0,29 814,71 ± 0,2912,16 ± 0,150,50 ± 0,0113,24 ± 0,23 914,55 ± 0,0910,24 ± 0,110,52 ± 0,0113,56 ± 0,23 1013,72 ± 0,294,14 ± 0,110,37 ± 0,0113,49 ± 0,16 1113,37 ± 0,181,66 ± 0,080,28 ± 0,0112,11 ± 0,22 129,52 ± 0,381,66 ± 0,110,27 ± 0,014,97 ± 0,23 * мг/(г·мин). Из табл. 2 видно, что максимальная активность α-амилазы, мальтазы, щелочной фосфатазы обнаружена при рН 8–9, 7, 8–9 и 9–10 соответственно. Оптимальные значения рН для казеинлитических протеиназ находятся в диапазоне 8–10. Данные оптимумы соответствуют таковым для рыб Волжского бассейна [3, 4]. Заключение Известно, что температурные характеристики ферментов отражают условия существования вида в историческом прошлом [3]. Ленский осетр, характерный представитель бассейна р. Лены, обитает в других температурных условиях, нежели представители Волжского бассейна. Возможно, именно с этим связано смещение у него температурных оптимумов α-амилазы и казеинлитических протеиназ в сторону более низких значений температуры. Кроме того, отмечается сходство ответных реакций пищеварительных ферментов на изменение температуры инкубации у ленского осетра и рыб, обитающих в арктических широтах. Таким образом, подтверждено, что адаптационные перестройки пищеварительной системы пойкилотермных организмов реализуются главным образом благодаря перестройкам ферментных систем. Можно предположить, что, по-видимому, имеет место эволюционная адаптация гидролитической функции кишечника рыб к условиям среды обитания.
Список литературы

1. Уголев А. М. Мембранное пищеварение и процессы усвоения пищи в мире животных // Журн. эволюц. биохим. и физиол. – 1972. – Т. 8, № 3. – С. 269–278.

2. Уголев А. М., Кузьмина В. В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. – СПб.: Гидрометеоиздат, 1993. – 283 с.

3. Невалённый А. Н., Туктаров А. В., Бедняков Д. А. Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеварения у рыб. – Астрахань: Изд-во АГТУ, 2003. – 152 c.

4. Невалённый А. Н., Бедняков Д. А., Новинский В. Ю. Исследование некоторых характеристик ферментов, обеспечивающих процесс мембранного пищеварения у веслоноса Polyodon spathula // Вопр. ихтиологии. – 2010. – Т. 50, № 3. – С. 400–404.

5. Бедняков Д. А., Новинский В. Ю., Невалённая Л. А. Комплексное исследование особенностей мембранного пищеварения у севрюги // Вестн. Астрахан. гос. техн. ун-та. Сер.: Рыбное хозяйство. – 2011. – № 2. – С. 74–77.

6. Бедняков Д. А. Температурные адаптации ферментов слизистой оболочки кишечника русского и ленского осетров и их гибрида // Юг России. Экология, развитие. – 2010. – № 4. – С. 49–52.

7. Невалённый А. Н., Бедняков Д. А., Дзержинская И. С. Энзимология. – Астрахань: Изд-во АГТУ, 2005. – 102 с.

8. Глинский В. В., Ионин В. Г. Статистический анализ: Руководство по обучению. – М.: ИНФРА-М; Новосибирск: Сибир. соглашение, 2002. – 241 с.

9. Уголев А. М., Тимофеева Н. М., Груздков А. А. Адаптация пищеварительной системы // Физиология адаптационных процессов. – М.: Наука, 1986. – С. 371–481.

10. Невалённый А. Н., Левченко О. Е., Коростелёв С. Г. Влияние температуры инкубации на уровень активности пищеварительных ферментов кеты (Oncorhynchus keta) // Вестн. Рос. ун-та дружбы народов. Сер.: Экология и безопасность жизнедеятельности. – 2005. – № 2 (12). – С. 89–91.

11. Кузьмина В. В., Морозова Е. Н. Влияние температуры на активности α-амилазы у пресноводных костистых рыб // Вопр. ихтиологии. – 1977. – Т. 17, № 5. – С. 922–929.