Текст (PDF):
Читать
Скачать
Нефтяное загрязнение является одним из ведущих факторов антропогенного воздействия на водные экосистемы. Углеводороды нефти, попадая в водоем, влияют на все этапы жизненного цикла гидробионтов, в том числе и рыб. В случае рыб, помимо непосредственного токсического воздействия, углеводороды нефти приводят в негодность нагульные участки и нерестилища, затрудняют, а чаще всего нарушают миграции рыб, вызывают массовые заболевания, ослабляя общую устойчивость их организма [1]. Кроме того, различные химические загрязнители, включая компоненты буровых растворов, поверхностно активные вещества, детергенты и дисперсанты влияют на выработку сигнальных веществ, синтезируемых в организме рыб и выделяемых с целью передачи информации другим особям того же вида, и неблагоприятно сказываются на хемосенсорном и половом поведении, нарушают пищевые реакции рыб [2]. Даже ничтожные концентрации нефти (0,1 мг/л) придают рыбе привкус и запах, неустранимые ни при какой технологической обработке, делая ее непригодной в качестве пищи [3]. Основным путем поступления углеводородов в водоемы являются аварийные разливы в процессе добычи и транспортировки нефти. В России одна из крупнейших аварий произошла в 1994 г. в Усинском районе Республики Коми, в результате которой произошла утечка более 200 тыс. т нефтесодержащей жидкости [4]. Через несколько лет после аварии в районе загрязнения стала отмечаться рыба с отклонениями в строении тела. Наиболее часто описывалась щука (Esox lucius) со значительно укороченной верхней челюстью [5]. В 2004-2005 гг. в районе загрязнения проводилась очистка воды и донных отложений от нефти. Было отмечено существенное снижение концентрации нефтепродуктов в донных отложениях, что способствовало появлению бентосных организмов, увеличению линейных показателей и темпа роста рыб [6]. В 2016 г. были проведены повторные исследования, которые показали эффективность очистки водоемов для гидробионтов в целом [7]. Целью исследования, результаты которого изложены в предлагаемой статье, стало изучение генетического полиморфизма щуки из районов, подвергавшихся нефтяному загрязнению. Материалы и методы исследований Материал для исследований был собран в летний период 2016 г. в озерах Щучье (№ 1-3) и оз. Безымянное (рис. 1). Система озер Щучьих расположена в Усинском районе Республики Коми, за Северным Полярным кругом. Она представляет собой термокарстовые слабопроточные озера, связанные между собой ручьями, и является истоком р. Воргаёль. В данном регионе развита добыча нефти, что ведет к загрязнению водных экосистем. Так, согласно данным исследований 2004-2005 гг., концентрация нефтепродуктов в донных отложениях оз. Щучье № 1 достигает 5 г/кг, в воде - 0,3-0,6 мг/л [4, 8]. Для первого показателя нормативы ПДК находятся на стадии разработки - предлагается принять норму 1 г/кг; ПДК для нефтепродуктов в воде составляет 0,1 мг/л (ГОСТ 1843-52). Оз. Щучье № 2 выступает как накопитель нефтяного загрязнения, поступающего по ручью из оз. Щучье № 1 [8]. Рис. 1. Схема озер Щучьих и оз. Безымянное Озеро Безымянное служило в работе в качестве фонового, не затронутого нефтяным загрязнением. О благополучном состоянии экосистемы этого водоема свидетельствуют данные исследований зоопланктонных и бентосных сообществ [8], концентрация нефтепродуктов в донных отложениях оставила 0,7 г/кг (устное сообщение Ю. А. Носкова). Кроме того, как контроль (без загрязнения нефтепродуктами) рассматривались водоемы Европы, сведения о полиморфизме популяций щуки которых взяты из литературы и базы данных GenBank Национального центра биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information (NCBI), США). Отлов рыбы проводился ставными сетями с размерами ячеи 18 и 24 мм и длиной 50 м. За период полевых работ было отобрано 102 экз. рыб, из которых 14 экз. были щуки: 10 экз. отловлено в озерах Щучьих и 4 экз. - в оз. Безымянное. Остальной улов составляли плотва (Rutilus rutilus) и окунь (Perca fluviatilis). Весь ихтиологический материал был подвергнут биологическому анализу по общепринятым методикам [9, 10]. Дальнейший генетический анализ был проведен для 14 экз. щук. Для анализа полиморфизма митохондриальной ДНК (мтДНК) щуки использовали кусочки ткани (белая мышца), фиксированные 96 %-ным этанолом (1:5). Клеточную ДНК выделяли с использованием набора реагентов ДНК-Экстран-2 (ЗАО «Синтол», Москва). Последовательность нуклеотидов определяли для двух участков мтДНК: фрагмента гена первой субъединицы цитохром с-оксидазы (Co-1) и части некодирующего региона, включающего точки начала транскрипции и репликации мтДНК - контрольной области, или D-петли. Синтез, или амплификацию, Co-1 проводили путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров F-COI-El и R-COI-El [11] в 25 мкл однократного буфера для амплификации (НПО «СибЭнзим», Новосибирск): 60 мМ трис-HCl (pH 8,5 при температуре 25 °С); 25 мМ KCl; 1,5 мМ MgCl2; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 % Тритон Х-100. Смесь содержала также 100-200 нг тотальной клеточной ДНК; по 0,25 пмоль каждого из двух праймеров; по 200 нмоль каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов и 0,5-1,0 единиц активности (ед. а.) Taq-ДНК полимеразы. Сверху, для предотвращения испарения в ходе ПЦР, на смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации включала этапы: денатурацию ДНК при температуре + 95 °C - 5 мин; 32 цикла синтеза фрагмента: + 95 °C - 1 мин, + 53 °C - 50 с и + 72 °C - 1 мин 15 с; заключительная достройка концов фрагмента: + 72 °C - 5 мин [12, с модификацией]. Для амплификации D-петли использовали праймеры CDLD и PIDL [13]. Реакционная смесь объемом 25 мкл включала: 200 нг тотальной клеточной ДНК, 2,5 мкл 10-кратного буфера (НПО «СибЭнзим»), по 2 пмоль каждого праймера, по 200 нмоль каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов и 1 ед. а. Taq-ДНК полимеразы. Для предотвращения испарения также использовали минеральное масло. Программа амплификации включала следующие этапы: начальный этап денатурации ДНК при температуре + 95 °C - 2 мин; 40 циклов синтеза фрагмента: + 94 °C - 55 с; + 50 °C - 55 с и + 72 °C - 1 мин 25 с; заключительная достройка концов фрагмента: + 72 °C - 10 мин [13]. Качество синтезированных образцов оценивали путем электрофореза в 1,3 %-ном агарозном геле с последующей визуализацией ПЦР-продуктов в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием. Размер фрагмента определяли с помощью стандартного ДНК-маркера GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (производитель - компания Thermo Fisher Scientific, США). Секвенирование проводили на автоматическом анализаторе 3500 ABI (8 капилляров) с использованием набора BigDye® Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (ABI PRISM®) на базе Института биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН. Протяженность нуклеотидной последовательности, определенной для D-петли мтДНК, варьировала у разных образцов от 411 пар нуклеотидов (п. н.) до 505 п. н.; длина секвенированного участка Co-1 составила около 584-685 п. н. Все последовательности депонированы в базу данных GenBank (NCBI) под номерами MG211741-MG211744. Чтение и анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей проводили в программах MEGA6 [14] и DnaSP v.5 [15]. Для построения сетей гаплотипов Co-1 и D-петли мтДНК использовали программу Network 5.0.0.0 [16]. В ходе анализа полученных данных, кроме описанных нами гаплотипов, были использованы последовательности из базы данных GenBank (NCBI). Результаты исследования и их обсуждение Среди щук, взятых для молекулярно-генетического анализа, не было экземпляров с отклонениями в морфологии и уродствами. Четырнадцать проанализированных последовательностей контрольного региона мтДНК щуки из озер Щучьих (№ 1-3) и оз. Безымянное оказались отнесены к двум гаплотипам - D1 и Shch1, первый из которых распространен и в водоемах Норвегии (номера последовательностей в NCBI: KM281491, KM281485). Для анализа был взят общий для всех последовательностей участок длиной 411 п. н. Следует отметить, что гаплотип D1 является наиболее частым у щуки исследованных нами водоемов: его носителями оказались десять (71,4 %) из 14 взятых для анализа особей. Вариант Shch1, выявленный только в озерах Коми, отличается от варианта D1 одной нуклеотидной заменой (р-дистанция 0,2 %). Основные показатели внутрипопуляционного полиморфизма D-петли мтДНК приведены в таблице. Различия между последовательностями этого фрагмента особей из озер Щучьих (№ 1-3) и оз. Безымянное и последовательностями, взятыми из базы данных GenBank (NCBI), не превышают максимальной дифференциации между гаплотипами контрольной области щуки из водоемов Европы (Норвегия, Швейцария). Так, среднее значение р-дистанции между последовательностями щуки из водоемов Республики Коми и северными водоемами Европы составило 0,5 %. Показатели внутрипопуляционного полиморфизма щуки из водоемов Коми невелики (табл.). Интересно, однако, что они превышают таковые для польских популяций, несмотря на меньший объем наших выборок и меньшую длину анализируемого участка. Основные показатели внутрипопуляционного полиморфизма мтДНК щуки озер Республики Коми в сравнении с популяциями из других водоемов* Водоем Длина анализируемого фрагмента, п. н. N h Hd π Co-1 Озера Щучьи (№ 1-3); оз. Безымянное 600 14 2 0,44 0,00072 Юг Европы, р. Дунай [11] 651 374 20 - 0,00420 D-loop Озера Щучьи (№ 1-3); оз. Безымянное 411 14 2 0,44 0,00093 Озера Польши [17] 1350 33 3 0,16 0,00060 Водоемы Европы и Канады [18] 273 47 8 0,72 0,00350 * N - число проанализированных последовательностей; h - число гаплотипов; Hd - гаплотипическое разнообразие; π - нуклеотидное разнообразие. Для Cо-1 фрагмента щуки из исследованных озер также описано два гаплотипа - С2 и С3 (рис. 2). Для анализа взят общий для всех последовательностей участок длиной 584 п. н. Наиболее частый вариант - С2, отмеченный у 71,4 % взятых для анализа особей, характерен и для водоемов Европы (номера последовательностей в NCBI: Чехия - HQ960989, Швеция - KJ128485). Второй гаплотип (С3) был также выявлен в популяции щуки из оз. Плещеево в Ярославской области (номер в NCBI - KT989772). Следует отметить, что в Центральной Европе распространен вариант, не обнаруженный в водоемах Республики Коми, - С1 (номера последовательностей: HQ960994, KM286646, KM224813, KM224852, KT989773, KR053389, HM563693). p-Дистанция между этим вариантом и вариантами С2 и С3 варьировала от 0,2 до 0,5 % (среднее значение 0,3 %), не превышая, таким образом, уровня внутривидового полиморфизма. Анализ сети гаплотипов Со-1 мтДНК, построенной с использованием данных NCBI о 37 последовательностях, позволяет обсуждать происхождение и филогенетические связи популяций щуки из озер Коми с популяциями других водоемов. Все последовательности, взятые в анализ, могут быть объединены в три группы с довольно четкой географической приуроченностью (рис. 2). Рис. 2. Сеть гаплотипов Со-1 фрагмента мтДНК щуки (E. lucius). Сеть построена с использованием данных базы NCBI. Обозначения популяций: белый квадрат - водоемы Турции; черный квадрат - водоемы Греции; треугольник - Казахстан; белый цвет - популяции Центральной Европы; серый - оз. Плещеево; волнообразная заливка - популяции Северной Европы; черный - исследованные популяции Республики Коми. Диаметр круга соответствует частоте конкретного варианта. Число нуклеотидных замен между вариантами равно единице, если не указано иное. Эллипсы ограничивают три гаплогруппы Со-1 щуки Так, первая группа включает гаплотипы щуки из водоемов Греции, Турции, Македонии (южная линия). Вторая группа объединяет варианты, отмеченные в популяциях E. lucius преимущественно Центральной Европы, а третья, куда входят варианты, обнаруженные в водоемах Северной Европы (Скандинавский п-ов), и гаплотипы из популяций щуки, обитающих в озерах Республики Коми, представляет собой северную филогенетическую линию. Рассчитанные значения р-дистанции показали наибольшую дифференциацию между первой и третьей группами гаплотипов - 0,7 %. Минимальными были значения показателя при сравнении второй и третьей групп (0,4 %). В случае D-петли данных в GenBank, доступных для сравнительного анализа, значительно меньше. Однако использование информации о 23 последовательностях щуки из европейских водоемов подтверждает данные, полученные при анализе сети гаплотипов Co-1, в частности вывод о бóльшей близости щуки из популяций водоемов Республики Коми популяциям E. lucius из водоемов Северной Европы. Следует отметить, что различий в уровне полиморфизма между выборками из озер, подвергавшихся нефтяному загрязнению (оз. Щучьи), и водоемов, благополучных в этом отношении (оз. Безымянное, водоемы Европы), на данном этапе исследований не выявлено. Возможно, это связано с недостаточным объемом выборок. Для получения корректных в этом плане данных требуется увеличение объема проанализированного материала, а также анализ полиморфизма популяций с использованием маркеров ядерного генома, характеризующихся более высокой скоростью эволюции (например, микросателлитов). Выводы Таким образом, анализ полиморфизма двух участков мтДНК выявил низкий уровень генетического разнообразия популяций щуки из озер Республики Коми. В то же время не вызывает сомнений факт большей филогенетической близости щуки E. lucius исследованного региона популяциям щуки из водоемов Северной Европы.