Текст произведения
(PDF):
Читать
Скачать
Введение Проблема внутривидовой дифференциации в современных биологических исследованиях во многом остается открытой [1, 2]. Использование классического морфологического метода [3–5] не всегда позволяет определить систематическое положение исследуемой группы организмов [6]. Применение дополнительных методов, в частности молекулярно-генетических, повышает уровень значимости полученных данных. В этой связи, при изучении внутривидовой дифференциации налима (Lota lota L.) Обь-Иртышского бассейна, было решено наряду с морфологическими, физиологическими, экологическими, этологическими и географическими методами применить и один из молекулярно-генетических. Систематическое положение и внутривидовая дифференциация налима в современной отечественной и зарубежной литературе несколько различаются [7–9], что является следствием использования разных методов. По свидетельству многих авторов [10–14], группировки налима в описываемых ими водоемах более или менее однородны, т. е. статистически значимо не различаются по морфологии, поведению, экологии, популяционной структуре и т. д. Исключением могут являться крупные речные системы. К таким речным системам однозначно можно отнести Обь-Иртышский бассейн, в котором обитает крупнейшая в мире группировка налима [15]. Условия обитания налима в разных частях бассейна очень сильно различаются (верховые проточные озера, русловые участки, широтные отличия и т. д.), дополнительное влияние оказывают огромные расстояния, препятствующие свободному обмену генами, и Новосибирская плотина, построенная в 50-е гг. ХХ в. Все это должно привести к генетической неоднородности население налима Обь-Иртышского бассейна. На базе Института экологии растений и животных Уральского отделения РАН было начато изучение генетического разнообразия L. lota с использованием микросателлитных маркеров. Так как методика исследования изменчивости микросателлитной ДНК налима в России пока не отработана, то во многом работа является пионерной для данного вида на территории России. Результаты настоящей работы – первый шаг в определении внутривидовой структуры налима в Обь-Иртышском бассейне и в других речных и озерных системах России. Задача исследования – тестирование микросателлитных праймеров, разработанных для популяций налима из Европы и Китая; оценка их пригодности для изучения генетической структуры населения налима российской части Обь-Иртышского бассейна, а также оптимизация методики микросателлитного анализа. Постановка задачи Налим – циркумполярный вид, широко распространен в Северном полушарии, однако работы по изучению его популяционно-генетической структуры редки и касаются в основном группировок налима на территории Европы и Китая [16–19]. Полная картина генетической структуры на протяжении всего ареала отсутствует. До недавнего времени основным инструментом для получения информации о генетической структуре популяций различных видов рыб было использование изоферментных генетических маркеров [20]. В последнее время среди молекулярно-генетических методов, используемых в популяционно-экологических исследованиях, особое внимание уделяется анализу микросателлитной ДНК [21]. Выявляемый с их помощью уровень ДНК полиморфизма на порядок выше аллозимной изменчивости [22]. Микросателлитные локусы ядерной ДНК (микросателлиты – от англ. microsatellites, или STR-локусы – Short Tandem Repeats, или SSR-локусы – Simple Sequence Repeats) представляют собой фрагменты ДНК с большим количеством тандемно повторяющихся идентичных «мотивов» или «повторов»: коротких последовательностей из нескольких (от одной до шести) пар нуклеотидов. Микросателлиты встречаются в большом количестве в геномах всех эукариот и локализованы как в некодирующих, так и в кодирующих (значительно реже) участках генома [23]. В классе рыб микросателлитный локус встречается приблизительно на каждые 10 000 пар нуклеотидов (пн), тогда как минисателлитный локус – на каждые 1 500 000 пн [24]. STR-локусы высокополиморфны, что делает их эффективными маркерами при детальных популяционно-экологических исследованиях [25]. По всей видимости, такая высокая вариабельность микросателлитов объясняется более высокими темпами их мутирования по сравнению с мутабильностью остальной геномной ДНК, составляющей около 10–2–10–6 на локус за поколение против 10–5–10–6 у структурных генов [21, 26–27]. Считается, что микросателлитные локусы селективно нейтральны, однако имеются данные об эффектах микросателлитной ДНК по отношению к некоторым фенотипическим характеристикам, включая организацию и функционирование генома эукариот [23, 25]. Высокий уровень полиморфизма, кодоминантный тип наследования и связанная с этим возможность легкой идентификации гомо- и гетерозигот делают микросателлиты удобным генетическим маркером для изучения генетических и демографических процессов в популяциях живых организмов. Изучение популяционно-генетической структуры представляет большой научный, а для видов растений и животных, имеющих большое хозяйственное значение, – и практический интерес. Особенно актуально знание популяционно-генетической структуры видов рыб, которые становятся объектом все более интенсивного хозяйственного использования человеком. Материал и методика исследований Сбор материала проводили зимой 2012–2013 гг. Для тестирования микросателлитных локусов использовали ткани рыб, взятых из двух мест (по 4 особи из каждого) Обь-Иртышского бассейна (рис. 1). Первый район сбора материала – р. Собь, левобережный нерестовый приток Нижней Оби. Выборка взята от производителей, пришедших на нерест. Вторая выборка собрана в нижнем течении р. Иртыш в Уватском районе Тюменской области. Для анализа ДНК были зафиксированы пробы белых мышц в 96 %-м этаноле. Тотальную ДНК выделяли из мышечной ткани методом солевой экстракции [28] с некоторыми модификациями. К измельченной и высушенной от этанола мышечной ткани добавляли 270 мкл буфера (25 мМ ЭДТА, 75 мМ NaCl, 10 мМ Tris (pH 7,5)), 30 мкл 10 %-го раствора SDS и 15 мкл протеиназы К (20 мкг/мкл), инкубировали при температуре 37 °С в течение 12–16 часов. К полученному в результате лизиса продукту добавляли 200 мкл 6М-го раствора NaCl, центрифугировали 15 минут на максимальной скорости, супернатант переносили в новые пробирки и повторяли последний шаг. На следующем этапе к супернатанту добавляли 3 объема 96 %-го этанола (1 500 мкл) и инкубировали в течение 2 часов при температуре –20 °С, затем центрифугировали на максимальной скорости 20 минут при температуре +4 °С. Полученный осадок, содержащий тотальную ДНК, два раза (1 000 мкл и 500 мкл соответственно) промывали в 70 %-м этаноле, высушивали при комнатной температуре и растворяли в 100 мкл воды. Рис. 1. Места отбора проб: 1 – левобережный уральский приток Нижней Оби р. Собь; 2 – участок р. Иртыш (Уватский район Тюменской области) Оценку качества полученных препаратов тотальной ДНК проводили электрофоретическим методом, используя 1 %-й агарозный гель, содержащий бромистый этидий и ДНК фага λ, гидролизованной эндонуклеазой BgII, в качестве маркера длин фрагментов. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре для её последующего выравнивания для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Нами было подобрано и протестировано 6 пар праймеров, разработанных для европейских (Llo1, Llo11, Llo12, Llo32, Llo34) и китайских (EF139390) популяций налима, характеристика которых представлена в табл. 1. Критериями отбора было наличие полиморфизма по выбранным локусам, а также размер продуктов амплификации, подходящий для дальнейшего создания панели микросателлитных локусов для автоматического анализа на генетическом анализаторе ABI Prizm 3130. Выбранные праймеры были синтезированы ЗАО «Синтол» (г. Москва). Полимеразную цепную реакцию проводили в термоциклире MyCycler «Bio-Rad», с использованием следующих реактивов: смеси дезоксирибонуклеотидов и Taq-полимеразы – производитель «СибЭнзим» (г. Новосибирск), MgCl2 и ПЦР-буфера (100 мМ Tris-HCl (pH 8,8); 500 мМ KCl; 0,8 % Nonidet P40) – производитель «Fermentas» (г. Вильнюс). На первом этапе работы использовали состав и режим ПЦР, рекомендуемый авторами, разработавшими праймеры [19, 29]. В дальнейшем для повышения эффективности ПЦР опытным путем подбирали оптимальные условия: температуру отжига праймеров и концентрацию ионов Mg2+. Таблица 1 Характеристика исследованных микросателлитных локусов Локус Последовательности праймеров (5`–3`) Повторяющаяся последова-тельность Диапазон аллельных размеров, пн Темпе-ратура отжига, °С Число аллелей / ожидаемая гетерозиготность Источник информации Llo1 F: CCTAACTCGCTGTGTCACTTTC R: GCACTGTTTAATGCCACTGC (TG)25 170–200 55 12/0,84 [29] Llo11 F: TGCTGGCTACAGTGGAGGAG R: CGAGCGTTAAAGAGCTGAAG (AC)17 136–142 5/0,56 Llo12 F: CAAACTGCTCTGCTGTCTGC R: TCTGTCGAGACTTGGGAAGG (CA)22 150–168 7/0,65 Llo32 F: CACTCCCGAAAAATAAACAC R: GTTTTCACCCTTCTTACGTG (GA)26 207–243 13/0,85 Llo34 F: AAGAAGATTGCACAGAGAGC R: TGACAGTGTTTCCAGACAAG (GA)30 T(GA)37 260–294 17/0,88 EF 139390 F:AACAACACCACCCTGACCT R:ATCATGGTGGGACTCCAGAC (CA)32 103–225 59 14/0,93 [19] Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 2 %-м агарозном геле в ТАЕ-буфере с бромистым этидием (5 мкг/мл) и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом излучении. Приблизительный размер каждого фрагмента определяли путем сравнения со стандартом молекулярной массы – маркером 100 bp + 50 bp («СибЭнзим» (г. Новосибирск)). Для более точного определения размеров фрагментов использовали электрофорез в полиакриламидном денатурирующем геле. Результаты исследований и их обсуждение При использовании состава и режима ПЦР, рекомендуемых авторами, разработавшими праймеры [19, 29] (табл. 2), не все исследуемые локусы поддерживали реакцию амплификации. Так, праймеры Llo32, Llo34 и EF139390 не дали в результате ПЦР ампликонов, а для праймеров Llo1, Llo11 и Llo12 наблюдалось наличие продуктов неспецифических реакций амплификации. Эффективность ПЦР зависит от многих параметров, таких как температура отжига праймеров, их концентрация, концентрация ионов Mg2+, а также от количества циклов амплификации, концентрации ДНК-матрицы и др. Дальнейшие исследования были направлены на поиск оптимальных условий амплификации и улучшения состава смеси для ПЦР. Была проведена модификация состава ПЦР-реакции. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 2 мкл ДНК (40–100 нг), 1 мкл каждого праймера (2 мкМ), 0,2 мкл смеси дезоксирибонуклеотидов (10 мМ каждого), 0,6 мкл MgCl2 (25 мМ), 1 мкл 10Х ПЦР-буфера, 0,1 мкл Taq-полимеразы (5 ед/мкл) и 4,1 мкл воды. Полимеразную цепную реакцию проводили по следующей схеме: начальная денатурация – 2 минуты при температуре 94 °С, затем 35 циклов (94 °С – 10 с, отжиг праймеров – 10 c, 72 °С – 30 c) и конечная элонгация 3 минуты при температуре 72 °С. Следует отметить, что среди условий ПЦР большое значение имеет температура отжига праймеров. Согласно рекомендациям разработчиков используемых праймеров, оптимальная температура отжига составляет 55 и 59 °С (табл. 2). Однако при использовании рекомендуемых температур ПЦР-продукты ожидаемых размеров были получены только для трех из шести исследуемых локусов, а именно Llo1, Llo11 и Llo12. В этой связи, для улучшения результатов ПЦР, эмпирическим путем были подобраны значения температуры отжига с использованием температурного градиента от 50 до 65 °С. Применение технологии температурного градиента позволяет одновременно проводить инкубацию при восьми различных значениях температуры, что оптимизирует проведение реакций за одну процедуру. Таблица 2 Состав реакционной смеси и условия для проведения ПЦР с микросателлитными праймерами, разработанными для налима из европейских и китайских популяций Состав реакционной смеси Компонент Локус Llo1, Llo11, Llo12, Llo32, Llo34 EF139390 Вода До 10 мкл До 25 мкл Смесь дезоксирибонуклеотидов 200 mkM each dNTP – 0,8 мкл 2 mM each dNTP ПЦР-буфер 10xBuffer (100mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15mM MgCl2) – 1 мкл 1xBuffer (Shanghai Sangon Company, China) MgCl2 – 1,5 мМ Праймер F 0,2 mkM – 1 мкл 0,1 mkM Праймер R 0,2 mkM – 1 мкл 0,1 mkM ДНК- полимераза 0,2 U Sigma RedTaq 1 U Taq ДНК Около 5 нг Около 100 нг Условия ПЦР Процесс Llo1, Llo11, Llo12, Llo32, Llo34 EF139390 Температура Время Температура Время Начальная денатурация 94 °С 2 мин 94 °С 3 мин Денатурация 94 °С 10 с 35 циклов 94 °С 30 с 30 циклов Отжиг праймера 55 °С 10 с 59 °С 30 с Достройка цепи 72 °С 30 с 72 °С 30 с Конечная элонгация 72 °С 60 мин 72 °С 7 мин Результаты ПЦР с применением температурного градиента представлены на рис. 2, на котором видно, что оптимальной температурой отжига для праймеров Llo1, Llo 11 и Llo 12 является температура 62 °С. Праймеры Llo 32, Llo 34 и EF139390 не дали ожидаемого результата, несмотря на варьирование температуры отжига, при этом для праймеров Llo 32 и Llo 34 наблюдалось наибольшее количество ожидаемого ПЦР-продукта при температуре отжига 51 °С, а для праймера EF139390 – при температуре 62 °С. Рис. 2. Результаты ПЦР с применением температурного градиента: А – Llo1; Б – Llo11; В – Llo12 (дорожки 17–24) и Llo32 (дорожки 25–32); Г – Llo34 (дорожки 33–40) и EF139390 (дорожки 41–48). Значения температуры отжига праймеров при амплификации ДНК налима по каждому исследуемому локусу варьировали в диапазоне от 65 до 50 ºС (курсив под каждой дорожкой). Для электрофоретического анализа ПЦР-продуктов использовали ДНК-маркер100 bp. Концентрация ионов Mg2+ – 1,5 мМ В дальнейшем был проведен электорофорез в 6 %-м полиакриламидном денатурирующем геле с серебряным окрашиванием, при этом в анализе использовали только те фрагменты, которые наиболее легко визуализировались на агарозном геле (Llo1, Llo11, Llo12). Как видно на рис. 3, у всех восьми тестируемых особей налима присутствует ПЦР-продукт по двум из трех исследуемых локусов (Llo1 и Llo11), при этом размер фрагментов укладывается в диапазон размеров аллелей, наблюдаемых в европейской популяции налима [29]. По локусу Llo12 не удалось получить ПЦР-продукт для половины анализируемых образцов, поэтому он не может быть рекомендован для дальнейшей работы. Тем не менее все три локуса оказались в разной степени полиморфными. Рис. 3. Электрофорез в ПААГ ПЦР-продуктов трех локусов (Llo1, Llo11 и Llo12) налима из двух популяций (1–4 – 4 особи налима из р. Собь; 5–8 – 4 особи налима с участка р. Иртыш). Разными геометрическими фигурами обозначены отдельные аллели. Концентрация ионов Mg2+ – 1,5 мМ Для оптимизации ПЦР с праймерами Llo32, Llo34 и EF139390 помимо технологии температурного градиента использовали варьирование концентраций ионов Mg2+. Ионы Mg2+ являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы в ПЦР. Многие компоненты реакционной смеси связывают эти ионы, в том числе ДНК-матрица, праймеры, ампликоны и дНТФ. При увеличении концентрации Mg2+, как правило, происходит и увеличение концентрации специфического продукта, однако избыток концентрации ионов магния может приводить к появлению неспецифичных продуктов реакции. На рис. 4 представлены результаты ПЦР, проведенной с использованием градиентов температуры и концентрации ионов Mg2+. Рис. 4. Результаты ПЦР с применением температурного градиента и варьированием концентрации ионов Mg2+: Увеличение концентрации ионов Mg2+ до 2,5 мМ (на рис. 2 и 3 представлены результаты ПЦР для всех шести исследованных пар праймеров с концентрацией в реакционной смеси Mg2+ 1,5 мМ) при проведении ПЦР с праймером Llo32 позволило увеличить эффективность накопления специфического ПЦР-продукта при температуре отжига равной 51 °С. Однако при дальнейшем увеличении концентрации Mg2+ до 3,5 мМ, как это видно на рис. 4, интенсивность специфической полосы уступала таковой при концентрации 2,5 мМ. Увеличение концентрации Mg2+ для праймеров Llo34 и EF139390 не принесло желаемого результата – интенсивность специфической полосы не увеличилась, а для локуса EF139390, наоборот, понизилась, при этом на электрофореграмме наблюдаются дополнительные полосы неспецифичных продуктов реакции. Таким образом, оптимальными концентрациями Mg2+ при проведении ПЦР для праймеров Llo1, Llo11 и Llo12 следует признать концентрацию 1,5 мМ, а для Llo32 – 2,5 мМ, которые обеспечивают высокий выход специфического продукта реакции без дополнительных неспецифических фрагментов. Однако результаты ПЦР с LLo32 не всегда хорошо воспроизводились в повторных реакциях, что не позволяет рекомендовать его для массового генотипирования исследуемых выборок налима. Заключение Таким образом, нами было апробировано шесть микросателлитных локусов, разработанных для европейской и китайской популяций налима, из которых два (Llo1 и Llo11) уверенно можно рекомендовать для дальнейшей работы. Для этих локусов были подобраны оптимальные условия проведения ПЦР (табл. 3). Таблица 3 Оптимизированный состав реакционной смеси и условия проведения ПЦР с микросателлитными праймерами Llo1 и Llo11 для налима из Обь-Иртышского бассейна Компонент Состав реакционной смеси Вода До 10 мкл Смесь дезоксирибонуклеотидов 10 mM each dNTP – 0,2 мкл ПЦР-буфер 10x Taq Buffer with KCl – 1 мкл MgCl2 25 mM – 0,6 мкл Праймер F 2 mkM – 1 мкл Праймер R 2 mkM – 1 мкл ДНК-полимераза 5 U/mkl Taq – 0,1 мкл ДНК 40–100 нг – 2 мкл Условия ПЦР Процесс Температура Время Начальная денатурация 94 °С 2 мин Денатурация 94 °С 10 с 35 циклов Отжиг праймера 62 °С 10 с Достройка цепи 72 °С 30 с Конечная элонгация 72 °С 3 мин Исследования по тестированию праймеров и оптимизации ПЦР для двух данных микросателлитных локусов позволят в будущем успешно использовать их для выяснения особенностей внутривидовой дифференциации налима Обь-Иртышского бассейна. В дальнейшем планируется тестирование и разработка новых праймеров для создания панели из 8–10 микросателлитных локусов, необходимой для формирования референтной базы популяционно-генетических данных по налиму, которая не только поможет оценить историю формирования современного ареала, процессы расселения и изоляции его локальных популяций, но и определять принадлежность особей к тем или иным конкретным группировкам. Работа выполнена при финансовой поддержке Программы «Оценка состояния биологических ресурсов животного и растительного мира Урала и Ямала» 12-П-4-1043 и Проекта «Изучение структурных преобразований биоценозов полярной части Урала и прилегающих территорий в условиях промышленного освоения»12-4-3012-Арктика
