с 01.01.2018 по 01.01.2024
Мурманск, Мурманская область, Россия
Мурманская область, Россия
Мурманская область, Россия
Россия
Представлены результаты анализа качественного состава микробиоты кишечника садковой радужной форели, выращенной в условиях Крайнего Севера. Описаны культуральные, морфологические, тинк-ториальные, биохимические свойства выделенных бактериальных изолятов. Представлены результаты идентификации выделенных бактериальных изолятов, полученных с применением классических (традиционных) бактериологических методов и экспресс-метода MALDI-TOF MS. При использовании классических биохимических тест-систем была затруднена дифференцировка микроорганизмов до вида. Исследования различных морфолого-тинкториальных и биохимических характеристик не позволяют достоверно идентифицировать выделенные бактериальные изоляты до вида в связи с высокой биохимической вариабельностью выделенных микроорганизмов и выполняют лишь вспомогательную функцию. В результате идентификации микроорганизмов классическим биохимическим методом было определено, что большая часть микробиоты кишечника форели относилась к родам Bacillus и Pseudomonas, а остальные к родам Micrococcus, Klebsiella, Lactobacillus; удалось установить видовую принадлежность только одного изолята – Escherichia coli. В процессе проведения масс-спектрометрического анализа для всех выделенных изолятов были получены результаты идентификации микроорганизмов по белковому профилю. Показано, что для большей части бактерий (55 %), включенных в исследование, удалось получить результаты с высокой вероятностью видовой идентификации до категории А (Micrococcus luteus, Bacillus pumilus, Escherichia coli, Carnobacterium maltaromaticum, Klebsiella oxytoca), а для 45 % бактериальных изолятов (Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter) провели с высокой вероятностью идентификацию до рода (категория В). Из 11 микробных изолятов, идентифицированных как с помощью классического биохимического подхода, так и с помощью современного масс-спектрометрического метода, только 8 совпадали на уровне рода. Доминирующей группой микроорганизмов, выделенных нами из кишечника радужной форели, являлись псевдомонады и бациллы. В микробиоценозе слизистой рыб из группы молочнокислых были обнаружены бактерии Carnobacterium maltaromaticum.
форель, кишечник, слизистая, микроорганизмы, идентификация, протеолитическая активность бактерии, изоляты, масс-спектрометрия
Введение
Систематическое изучение микробного сообщества кишечника рыбы, выращиваемой в условиях аквакультуры, позволит скорректировать пути поддержания его в стабильном состоянии, что способствует повышению количества необходимых ферментов в пищеварительной системе рыбы при включении отдельных компонентов питания в ее рацион [1]. Поэтому для будущих исследований весьма важно, чтобы применяемые методы идентификации микроорганизмов помогали распознавать уникальные характеристики рыб и избегать применения протоколов, разработанных для наземных гомойотермных животных. В настоящее время наряду с традиционными методами стало возможным использование автоматизированных систем идентификации микроорганизмов, которые не требуют значительных временных и финансовых затрат. Широкое распространение получила методика определения степени соответствия уникального для каждого вида микроорганизма набора рибосомальных белков («протеомная дактилоскопия») с помощью десорбционного метода «мягкой» ионизации, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом на основе технологии матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight – MALDI-TOF MS) [2]. Несмотря на то, что MALDI-TOF MS – это «фенотипическая» система, она, в некотором смысле, заполняет пробел в достоверности результатов испытаний, полученных с помощью биохимических систем фенотипирования, а также идентификационных систем генотипирования [3].
Использование различных современных подходов к идентификации микроорганизмов, сочетающих стандартные микробиологические методы и современные автоматизированные «фенотипические» системы, позволит получить в дальнейшем достоверную картину взаимодействия макроорганизма с микробными сообществами и отнести их к определенному классу бонитета. Цель исследования – проведение сравнительного анализа эффективности идентификации микроорганизмов при исследовании микробиома кишечника садковой радужной форели (Oncorhynchus mykiss) с помощью комплексного подхода, сочетающего использование классического (традиционного) биохимического метода и современного экспресс-метода – времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS).
Материал и методы исследований
Исследования проводились на базе кафедры микробиологии и биохимии Мурманского государственного технического университета (с мая 2023 г. – Мурманский арктический университет) в рамках реализации инициативных научно-исследовательских работ «Комплексные исследования объектов аквакультуры в условиях Кольского Заполярья» № ГР АААА-А19-119030590051-4 (период реализации 01.2019–01.2023 гг.). Объектом исследования послужила пресноводная садковая радужная форель (Oncorhynchus mykiss) генераций 2018–2023 гг. Отбор проб рыбы проводили в период с сентября 2020 по март 2023 г. на форелевой садковой ферме, расположенной в районе п. г. т. Верхнетуломский. Все манипуляции с рыбой осуществляли с соблюдением международных биоэтических норм и требований при работе с животными [4]. Клинический осмотр и патологоанатомическое вскрытие рыбы проводили по стандартной методике [5], принятой в ихтиопатологии. Культуры микроорганизмов выделяли из образцов кишечной слизи и содержимого кишечника умерщвленной рыбы в соответствии с рекомендациями [6]. В зависимости от возраста рыбы объем кишечной слизи и содержимого рассчитывали по методике, разработанной коллективом авторов [7] (И. В. Ускова, В. А. Потешкина, К. А. Калинчук).
Кишечник от среднего до дистального отдела асептически отделяли от брюшной полости стерильными ножницами и перемещали в стерильную чашку Петри. Вырезанный сегмент кишечника осторожно очищали от брыжеечного жира и вскрывали продольно. Слизистую и содержимое кишечника анализировали отдельно. Сначала извлекали содержимое кишечника в отдельную чашку Петри, а затем, после отмывки в 0,9 %-м физиологическом растворе, соскребали слизь стерильным скальпелем. Полученные образцы слизи и содержимого кишечника перемещали в стерильные пробирки с 0,9 %-м физиологическим раствором в объеме 1/10. Из исходного разведения готовили ряд последовательных десятикратных разведений и высевали в жидкие накопительные среды (первичный посев) – Бликфельдта (НПЦ «Биокомпас-С», Россия) и ГМФ-бульон (НИЦФ, Россия) в двух-трехкратных повторностях. Посевы инкубировали в аэробных условиях при температуре 18 ± 3 °С в течение 7–14 дней [8]. Просмотр посевов проводили ежедневно, отмечая интенсивность и характер роста микроорганизмов в жидких средах: в ГМФ-бульоне наблюдали диффузное помутнение среды, образование пристеночного кольца, пленки, осадка; в среде Бликфельдта – изменение цвета среды с фиолетового на желтый. Для получения изолированных колоний стерильной петлей делали пересевы культур из каждого посева с видимыми признаками роста на поверхность чашки Петри с плотной питательной средой: Бликфельдта (НПЦ «Биокомпас-С», Россия), ГМФ-агара (НИЦФ, Россия). После 7 дней инкубирования отмечали размер, рельеф, контур края, поверхность, цвет, консистенцию колоний [9].
Чистоту выделенных чистых культур микроорганизмов проверяли визуально (рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенного агара), микроскопически (окраска по Граму и микроскопия с иммерсионной системой). Следует иметь в виду, что заключение о чистоте некоторых культур микроорганизмов нельзя сделать только по результатам высева на вышеуказанные питательные среды. Особенно это касается представителей гетеротрофов, склонных развиваться с одним или несколькими спутниками [10]. Таким образом, дополнительно чистоту культур микроорганизмов проверяли высевом на ряд сред производства ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск, Россия): агар-ЭНДО-ГРМ для выделения энтеробактерий, SS-агар для выделения сальмонелл и шигелл, XLD-агар для выделения и идентификации патогенных энтеробактерий, дифференциально-элективная среда для выделения клебсиелл, среда № 10 для идентификации Staphylococcus aureus. Полученные изоляты идентифицировали с применением традиционного метода, основанного на исследовании морфолого-тинкториальных, культуральных и биохимических свойств с использованием определителя Берджи [11, 12] и современного лабораторного экспресс-метода – MALDI-TОF MS. Морфологические и тинкториальные особенности изучали с применением светового микроскопа Olympus CX23LEDRFS1 (Япония) с общим увеличением ×1 000. Фотосъемку препаратов проводили с помощью цифровой камеры ADF и программного обеспечения ADF Image Capture. Фиксированные и живые препараты готовили стандартными методами [13]. Для окраски по Граму использовали коммерческий комплект реагентов Микро-ГРАМ-НИЦФ (Россия). Биохимические свойства (сахаролитическая и протеолитическая активность) определяли как по стандартным методикам с использованием дифференциально-диагностических сред Гисса (индикатор бромкрезоловый пурпурный, мальтоза, ксилоза, рамноза, дульцит) фирмы Биокомпас-С (Россия), питательной желатины [14], так и коммерческих наборов для межродовой/видовой дифференцировки бактерий (системы индикаторных бумажек (СИБ) фирмы Микроген (Россия) – набор № 1 и 2, Микро-КАТАЛАЗА-НИЦФ (Россия) согласно рекомендации производителя).
Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре microfler MALDI-TOF MS с использованием программного обеспечения Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Германия) в линейном режиме. Реактивы, используемые для идентификации с помощью MALDI-TOF MS: бактериальный калибровочный стандарт Брукер (BTS), порционная альфа-циановая матрица Брукер (Bruker HCCAportioned Matrix), стандартный раствор (OS, 50 % ацетонитрил, 2,5 % трифторуксусная кислота, 47,5 % вода), ультрачистая вода (ASTM Type I), этанол абсолют ≥99,8 % (неденатурированный), муравьиная кислота (чистота ~ 98 %), ацетонитрил ≥99,9 для ВЭЖХ/МС (LC-MS grade). Калибровку масс-спектрометра проводили перед исследованием каждой серии идентификаций согласно руководству пользователя масс-спектрометра microfler MALDI-TOF MS Biotyper 3.0, используя в качестве калибранта бактериальный калибровочный стандарт Брукер (BTS). Для идентификации микроорганизмов использовали метод прямого нанесения материала единичной колонии микроорганизма на лунку металлического планшета масс-спектрометра стерильной одноразовой петлей. На лунку с нанесенным материалом капали матрицу и подсушивали. Затем мишень загружали в прибор для получения спектров. Для каждого исследуемого образца в методе MALDI-TOF MS использовали не менее 4-х повторений. С целью анализа полученных масс-спектров применяли программное обеспечение flexControl – для измерений, flexAnalysis – для контроля качества, Biotyper OC – для создания новых записей
в базе данных (MSP).
В процессе масс-спектрометрии определяются два параметра: отношение ионов к их заряду – m/z и количество частиц с конкретной величиной m/z. Зависимость этих двух величин называют масс-спектром (непрерывная зависимость на определенном интервале). В MALDI-TOF MS для видовой идентификации микроорганизмов используют иную характеристику – масс-спектр-профиль (МСП). В программном аппарате Bruker Daltonics для отображения силы сходства МСП неизвестного микроорганизма с типовым коллекционным штаммом используется переменная «score value». Также разработчики из Bruker Daltonics предложили категории (А, В, С), которые характеризуют не только совпадение с наиболее схожим МСП, но и отражают совокупность из 10 МСП, наиболее близких к исследуемому [15].
В соответствии с требованиями производителя при значениях коэффициента достоверности Score Value (SV) 1,6 и ниже идентификацию считали ненадежной. Для интерпретации полученных результатов применяли стандартные диапазоны значений коэффициента достоверности SV (табл. 1)
и категории идентификации (табл. 2) [16].
Таблица 1
Table 1
Значение Score Value
The Score Value
|
Диапазон коэффициента достоверности SV |
Описание |
Символ |
Цвет категории идентификации |
|
2,30–3,00 |
Достоверная видовая идентификация микроорганизмов |
(+++) |
Зеленый |
|
2,00–2,29 |
Достоверная родовая идентификация микроорганизмов. |
(++) |
|
|
1,70–1,99 |
Высокая вероятность родовой идентификации микроорганизмов |
(+) |
Желтый |
|
0,00–1,69 |
Нет точного результата идентификации |
(–) |
Красный |
Таблица 2
Table 2
Категории идентификации (A – C)
Identification categories (A – C)
|
Категория идентификации |
Описание |
|
A |
Все 10 наиболее вероятных кандидатов принадлежат к одному роду. Зеленая категория – точное видовое соответствие, желтая категория – точное родовое |
|
B |
Предложенные 10 наиболее вероятных кандидатов принадлежат к разным родам. Зеленая и желтая категории – видовое и родовое соответствие |
|
C |
Нет ни видового, ни родового соответствия. Проверьте родственные микроорганизмы |
Полученные результаты сравнивали с базой данных на NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Результаты и обсуждение
В результате исследования микробиома кишечника садковой радужной форели было выделено 11 различных микробных изолятов: 7 (№ 2, 5–8, 10, 11) – из содержимого, 4 (№ 1, 3, 4, 9) – из слизистой кишечника. Необходимо отметить, что наибольшее количество микробных изолятов выделено из содержимого кишечника рыб, что соответствует литературным данным. Так, в результате подсчета доминирующих форм микроорганизмов в кишечнике радужной форели (Oncorhуnchus mykiss) было выявлено, что на слизистой кишечника бактерий на 2–3 порядка ниже, чем в его содержимом [17]. Как правило, под воздействием различных стрессовых факторов нарушается уже сложившийся естественный баланс микробиома кишечника и, как следствие, бактерии намного слабее закрепляются на слизистой кишечника и легко удаляются вместе со слизью, что сопровождается значительным увеличением их количества в химусе [18]. В исследованиях P. M. Fidopiastis [19] на 15 различных питательных средах количество культивируемых форм микроорганизмов от общего числа бактерий, изолированных из кишечника морских растительноядных рыб, не превышало 5 %. По расчетам T. Ринго с соавторами [20], культивируется только 3 % микроорганизмов, выделенных из заднего отдела кишечника рыбы, что подтверждает результаты наших исследований. На этапе лабораторного эксперимента полученные изоляты идентифицировали с применением традиционного метода, основанного на исследовании морфолого-тинкториальных, культуральных и биохимических свойств с использованием определителя Берджи и современного лабораторного экспресс-метода – MALDI-TОF MS. Проведенные исследования позволили установить различия в идентификации бактерий по классическому биохимическому методу и MALDI-TOF MS. При исследовании культуральных свойств микробных изолятов в жидких питательных средах рост в накопительной среде ГМФ-бульон визуально обнаруживали в виде диффузного помутнения и образования поверхностных пленок. На жидкой среде Бликфельдта отмечали равномерное помутнение и изменение цвета с фиолетового на желтый за счет кислотно-основного индикатора (бромкрезолового пурпурного), входящего в ее состав.
На неселективной плотной питательной среде ГМФ-агаре установили следующие культуральные свойства изолятов: № 1 формировал округлые, пастообразные, ярко-желтые или золотистые колонии; № 2 – гладкие, не пигментированные колонии; № 3 – морщинистые с неровными краями, сероватые; № 4 – ровные, пастообразные, слегка желтоватые колонии; № 5 – плоские, слизистые, гладкие; № 6 – округлые, гладкие, слизистые; № 7 – округлые, выпуклые, с ровными краями, светло-бежевого цвета; № 8 – округлые, гладкие, серо-белые, блестящие, с ровными краями; № 10 – округлые, гладкие, слизистые, со слегка сероватым налетом; № 11 – округлые, с глянцевой поверхностью колоний, слегка сероватого цвета. На плотной среде Бликфельдта изолят № 9 формировал округлые, гладкие, выпуклые светло-бежевые колонии, с ровным краем, однородной консистенцией. Вокруг колоний отмечали диффузное изменение цвета среды с фиолетового на желтый. На агаре-ЭНДО-ГРМ изоляты № 5, 6, 10 – небольшие бледно-розовые колонии, № 8 – средние колонии (диаметром до 3 мм) малинового цвета с ярким металлическим блеском. На XLD-агаре изолят № 8 формировал средние (диаметр до 3 мм) круглые желтые колонии с зоной вокруг. На дифференциально-элективной среде для выделения клебсиелл изолят № 7 формировал средние (диаметр до 4 мм) круглые слизистые колонии малинового цвета. На SS-агаре и среде № 10 видимых признаков роста не зафиксировано в течение всего периода инкубирования. При исследовании морфологических и тинкториальных свойств выявили 5 грамположительных (№ 1–4, 9) и 6 грамотрицательных изолятов (№ 5–8, 10, 11). В морфологическом отношении преобладали палочковидные формы (№ 2–11). Микробные изоляты № 2–4 – спорообразующие.
Все исследованные изоляты протестировали на способность использовать различные субстраты с помощью коммерческих систем (СИБ № 1 и 2) фирмы «Микроген» (Россия), микро-КАТАЛАЗА-НИЦФ (Россия). Биохимические свойства выделенных чистых культур микроорганизмов представлены в табл. 3.
Таблица 3
Table 3
Биохимическая характеристика выделенных чистых культур микроорганизмов
Biochemical characteristics of isolated pure cultures of microorganisms
|
Показатель |
Микробные изоляты кишечника рыбы |
||||||||||
|
№ 1 |
№ 2 |
№ 3 |
№ 4 |
№ 5 |
№ 6 |
№ 7 |
№ 8 |
№ 9 |
№ 10 |
№ 11 |
|
|
Каталаза |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
+ |
|
Оксидаза |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
– |
+ |
+ |
|
b-галактозидаза |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
– |
|
Декарбоксилаза лизина |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
– |
|
Декарбоксилаза орнитина |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
|
Глюкоза |
– |
+ |
+ |
– |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
|
Сахароза |
– |
– |
+ |
– |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Лактоза |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
Мальтоза |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
Манноза |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
Ксилоза |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
|
Рамноза |
+ |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
Маннит |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
|
Дульцит |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
Сорбит |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
– |
|
Желатин |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
Индол |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
– |
|
Сероводород |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
Утилизация цитрата |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
– |
|
Утилизация малоната |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
– |
|
Реакция Фогеса – Проскауэра |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
– |
Большинство изолятов (№ 1–8, 10, 11) обладали каталазной активностью, изоляты № 1, 5, 6, 10, 11 обладали оксидазной активностью, а изоляты № 7, 8 – b-галактозидазной активностью. Способны декарбоксилировать диаминокислоты: лизин – изоляты № 7, 8, орнитин – изоляты № 1, 8. Определена способность изолятов № 7 и 8 ферментировать весь предлагаемый в лабораторных условиях спектр углеводов (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, манноза, ксилоза, рамноза) и многоатомных спиртов (маннит, дульцит, сорбит), а также образовывать индол. Изолят № 9 не ферментировал ксилозу и сорбит, № 6 не ферментирует лактозу, мальтозу, дульцит, сорбит. Остальные штаммы могли ферментировать от двух до четырех наименований углеводов и многоатомных спиртов. Утилизировать цитрат и малонат оказались способны изоляты № 1 и 7, продуцировать ацетоин (ацетилкарбинол) могли изоляты № 7 и 9. При исследовании протеолитической активности было выявлено, что изоляты № 1–4 оказались способны гидролизовать желатин в течение двух-трех недель.
Выявлено только две культуры бактерий, образующих фермент триптофаназу – изоляты № 7 и 8. Все изолированные микроорганизмы не способны восстанавливать сульфат до сероводорода (H2S) для получения энергии.
Таким образом, в результате идентификации микроорганизмов классическим биохимическим методом было определено, что большая часть относилась к родам Bacillus (№ 2, 3, 4) и Pseudomonas (№ 5, 6, 10, 11), а остальные к родам Micrococcus (№ 1), Klebsiella (№ 7), Lactobacillus (№ 9). Изолят № 8 идентифицировали до вида – Escherichia coli.
В процессе проведения масс-спектрометрического анализа полученных изолятов были получены результаты идентификации микроорганизмов по белковому профилю (табл. 4).
Таблица 4
Table 4
Идентификация микробных изолятов методом MALDI-TOF MS
Identification of microbial isolates by MALDI-TOF MS
|
№ изолята |
Значение SV |
Категория |
Символ |
Цвет категории идентификации |
Результаты идентификации |
|
1 |
2,1 ± 0,1 |
А |
(++) |
Зеленый |
Micrococcus luteus |
|
2 |
2,0 ± 0,04 |
А |
(++) |
Bacillus pumilus |
|
|
3 |
1,8 ± 0,09 |
В |
(+) |
Желтый |
Bacillus spp. |
|
4 |
2,0 ± 0,05 |
А |
(++) |
Зеленый |
Bacillus pumilus |
|
5 |
1,8 ± 0,05 |
В |
(+) |
Желтый |
Pseudomonas spp. |
|
6 |
1,8 ± 0,04 |
В |
(+) |
Pseudomonas spp. |
|
|
7 |
2,1 ± 0,05 |
A |
(++) |
Зеленый |
Klebsiella oxytoca |
|
8 |
2,2 ± 0,13 |
A |
(++) |
Escherichia coli |
|
|
9 |
2,1 ± 0,04 |
А |
(++) |
Carnobacterium maltaromaticum |
|
|
10 |
1,8 ± 0,05 |
B |
(+) |
Желтый |
Pseudomonas spp. |
|
11 |
1,9 ± 0,05 |
B |
(+) |
Achromobacter spp. |
Значение коэффициента достоверности SV варьировало в достаточно широком диапазоне – от 1,8 до 2,2. Из 44 снятых МСП не получено ни одного значения показателя SV, входящего в диапазон от 2,3 до 3,0 (см. табл. 4). Только для 6 (55 %) микробных изолятов (№ 1 – Micrococcus luteus, 2 – Bacillus pumilus, 4 – Bacillus pumilus, 7 – Klebsiella oxytoca, 8 – Escherichia coli, 9 – Carnobacterium maltaromaticum) удалось получить МСП, находящиеся в диапазоне значений коэффициента достоверности SV от 2,0 до 2,3 (см. табл. 4), что позволяло уверенно отнести их к категории А (точное родовое и видовое соответствие). Для 5 (45 %) микробных изолятов (№ 3 – Bacillus spp., 5 – Pseudomonas spp., 6 – Pseudomonas spp., 10 – Pseudomonas spp., 11 – Achromobacter spp.) удалось провести вероятную родовую идентификацию и отнести их к категории В.
Только для изолята № 8 удалось провести идентификацию до вида, что соответствовало результатам масс-спектрометрического анализа.
Сравнительные результаты идентификации микроорганизмов различными методами идентификации представлены в табл. 5.
Таблица 5
Table 5
Результаты идентификации микроорганизмов по классическому биохимическому методу
и масс-спектрометрии MALDI-TOF MS (белковому профилю)
Results of identification of microorganisms by the classical biochemical method
and MALDI-TOF MS (protein profile) mass spectrometry
|
№ изолята |
Биохимический метод |
MALDI-TOF MS |
|
1 |
Micrococcus spp. |
Micrococcus luteus |
|
2, 4 |
Bacillus spp. |
Bacillus pumilus |
|
3 |
Bacillus spp. |
Bacillus spp. |
|
5, 6 |
Pseudomonas spp. |
Pseudomonas spp. |
|
7 |
Klebsiella spp. |
Klebsiella oxytoca |
|
8 |
Escherichia coli |
Escherichia coli |
|
9 |
Lactobacillus spp. |
Carnobacterium maltaromaticum |
|
10 |
Pseudomonas spp. |
Pseudomonas spp. |
|
11 |
Pseudomonas spp. |
Achromobacter spp. |
Из 11 микробных изолятов, идентифицированных как с помощью биохимического метода, так и с помощью метода MALDI-TOF MS, только 8 (№ 1–7, 10) совпадали на уровне рода. У микробных изолятов № 9 и 11 провести при помощи стандартных биохимических подходов идентификацию до рода не удалось – белковый профиль идентификации соответствовал Carnobacterium spp. и Achromobacter spp. Поэтому с целью улучшения классических методов биохимической идентификации необходимо применять современные экспресс-методы [21, 22], такие как MALDI-TOF MS, который выполняет поиск по существующим базам белковых профилей микроорганизмов, что сопоставимо с идентификацией по 16sРНК [23].
Заключение
В результате исследований микробиоты кишечника садковой радужной форели выделены и идентифицированы 11 микробных изолятов с применением комплексного подхода для достижения максимально высокой чувствительности полученных результатов. Проведенное исследование подтвердило высокие возможности MALDI-TОF MS анализа для быстрой и точной идентификации микроорганизмов до видового уровня. Для 5 изолятов удалось провести с высокой вероятностью родовую идентификацию, доминирующей группой оказались псевдомонады и бациллы. Достоверную родовую и высокую видовую идентификацию удалось провести для 6 изолятов (см. табл. 5), из них два изолята (№ 2, 4) оказались одного вида (Micrococcus luteus, Bacillus pumilus, Escherichia coli, Carnobacterium maltaromaticum, Klebsiella oxytoca). В микробиоценозе слизистой рыб из группы молочнокислых микроорганизмов были обнаружены бактерии рода Сarnobacterium, а именно вид Carnobacterium maltaromaticum.
1. Зуева М. С., Мирошникова Е. П., Аринжанов А. Е., Килякова Ю. В. Современные исследования по изучению микробиома кишечника рыб // Животноводство и кормопроизводство. 2023. Т. 106. № 2. С. 198–213.
2. Глушанова Н. А., Блинов А. И., Алексеева Н. Б. Масс-спектрометрическая идентификация микроорганизмов // Медицина в Кузбассе. Кемерово: Медицина и просвещение, 2015. С. 36–41.
3. Gaudreau A. M., Labrie J., Goetz C., Dufour S., Jacques M. Evaluation of MALDI-TOF mass spectrometry for the identification of bacteria growing as biofilms // J. Microbiol. Methods. 2018. V. 145. P. 79–81. DOI:https://doi.org/10.1016/j.mimet.2018.01.003.
4. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals // Guide for the Care and Use of Laboratory Ani-mals. Washington, DC, USA: The National Academies Press, 2011. 246 p.
5. Лабораторный практикум по болезням рыб / под ред. В. А. Мусселиус. М.: Лег. и пищ. пром-сть, 1983. 296 с.
6. Kim D., Brunt J., Austin B. Microbial diversity of intestinal contents and mucus in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // J. Appl. Microbiol. 2007. V. 102. P. 1654–1664.
7. Ускова И. В., Потешкина В. А., Калинчук К. А. Комплексный мониторинг бактериопланктона рыбоводного хозяйства реки Тулома и энтеральной микробиоты кишечника, культивируемой в садках форели // Вестн. МГТУ. 2019. Т. 22. № 3. С. 432–440. DOI:https://doi.org/10.21443/1560-9278-2019-22-3-432-440.
8. Анттила П. Диагностика бактериальных болезней рыб (лабораторное пособие на основе практики финских специалистов) // НИИ Охотничьего и рыбного хозяйства Финляндии. М.: Аквариум, 2010. 43 с.
9. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: учеб. пособие / под ред. А. С. Лабинской, Л. П. Блинковой, А. С. Ещиной. СПб.: Лань, 2016. 588 с.
10. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: учеб. пособие / под. ред. Н. С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1995. 224 с.
11. Определитель бактерий Берджи: в 2-х т. М.: Мир, 1997. Т. 1. 432 с.
12. Определитель бактерий Берджи: 2-х т. М.: Мир, 1997. Т. 2. 368 с.
13. Нетрусов А. И., Котова И. Б. Микробиология: теория и практика: в 2 ч. М.: Юрайт, 2018. Ч. 1. 315 с.
14. Васильев Д. А. и др. Методы общей бактериологии: учеб.-метод. пособие. Ульяновск: Изд-во УлГСА, 2003. 129 с.
15. Clinical Microbiology MALDI Biotyper Fast & Ac-curate Identication of Microorganisms Innovation with Integrity MALDI-TOF. URL: https://pdf.directindustry.com/pdf/bruker-daltonics/maldi-biotyper/30029-313677.html (дата обращения: 15.08.2025).
16. Рябинин И. А., Ершова А. И., Батаева К. Д. Анализ идентификации и группировки масс-спектров, получаемых при MALDI-TOF-масс-спектрометрии белковых экстрактов из культур Aspergillus fumigatus Fres // Проблемы медицинской микологии. 2015. Т. 17. № 1. С. 52–57.
17. Spanggaard В., Huber I., Nielsen J., Nielsen T., Appel K., Gram L. The microflora of rainbow trout intestine: A comparison of traditional and molecular identification // Aquaculture. 2000. V. 182. Iss. 1–2. P. 1–15. DOI:https://doi.org/10.1016/S0044-8486(99)00250-1.
18. Olsen R. E., Sundell K., Hansen T., Hemre G. I., Myklebust R., Mayhew T. M., Ringo E. Acute stress alters the intestinal lining of Atlantic salmon, Salmo salar L.: An electron microscopical study // Fish Physiology and Bio-chemistry. 2002. V. 26. P. 211–221.
19. Fidopiastis P. M. Microbial activity in the gut of an herbivorous marine fish // Masters Abstracts International. 1996. V. 34. N. 3. P. 1102.
20. Ringo E., Lødemel J. B., Myklebust R., Kaino T., Mayhew T. M., Olsen R. E. Epithelium-associated bacteria in the gastrointestinal tract of Arctic charr (Salvelinus al-pinus L.). An electron microscopical study // Journal of Applied Microbiology. 2001. V. 90. P. 294–300. DOI:https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2001.01246.x.
21. Church D. L. Biochemical tests for the identification of aerobic bacteria // Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington: AMS Press, 2016. P. 3.17.1.1-3.17.48.3. DOI:https://doi.org/10.1128/9781555818814.ch3.17.
22. Reyes A. T. Morpho-biochemical aided identification of bacterial isolates from Philippine native pig // Adv. Pharmacol. Clin. Trials. 2018. V. 3 (5). P. 000148. DOI:https://doi.org/10.23880/apct-16000148.
23. Салгина А. В., Бондаренко Т. А., Иванова Е. В., Перунова Н. Б. Сравнение методов идентификации представителей рода Bifidobacterium // Вестн. ОГУ. 2014. № 13 (174). С. 92–95.
