Россия
Россия
Россия
Россия
Приведены результаты исследований по сравнению эффективности пробиотических добавок, раз-работанных для животноводства и разработанных для аквакультуры, в составе комбикормов для карпа. В комбикорм для контрольной группы включали промышленный пробиотик на основе B. subtilis, для опытных групп – пробиотические добавки c разными штаммами B. velezensis. Масса рыб в опытных группах 1 и 2 достоверно увеличилась в 1,3–1,4 раза по сравнению с рыбами контрольной группы, при этом абсолютный прирост был выше на 45,53 и 32,63 %, а коэффициент массонакопления на 25,81 и 19,35 % соответственно. Рыбы из опытных групп продемонстрировали лучшую адаптацию к изменяющимся условиям окружающей среды и повышенную устойчивость к стрессовым факторам. При оценке двигательной активности в тесте «открытое поле» у них наблюдалось снижение ориентировочной активности на 52 и 46 %, в то время как у контрольной группы – на 77 %, что свидетельствует о значительном торможении двигательной активности. Уровень фоновой двигательной активности рыб опытных групп был достоверно выше, чем у контрольной, в 2–3,6 раза. При воздействии низкочастотного звукового раздражителя двигательная активность увеличилась во всех группах в 1,5–3,6 раза по сравнению с фоновым уровнем, однако в контрольной группе реакция на данный раздражитель была наименьшей – 14,3 ед./мин. При кратковременном световом воздействии в контрольной группе рыбы практически прекратили движение, уменьшив активность в 6,5 раз, до 2,2 ед./мин. В опытных группах этот показатель был выше по сравнению с контролем в 3,3–3,5 раза. При воздействии третьего раздражителя (постоянный свет) наблюдались аналогичные тенденции. Жизнестойкость молоди карпа при экстремальной солевой нагрузке была наивысшей в первой опытной группе, которая получала комбикорм, включающий пробиотические бактерии B. velezensis MT14 и MT42. Среднее время выживания составило 16,7 ч, а уровень выживаемости – 30 %. Количество пробиотических бацилл в кишечнике рыб опытных групп через 30 дней эксперимента составляло около 50 %, а через 60 дней – 25 %. Доля вегетативных клеток составила 94–95 % после месяца выращивания, после двух месяцев – 76–86 %, что указывает на высокую приживаемость пробиотиков. В контрольной группе количество промышленного пробиотика в кишечном содержимом рыб уменьшилось на 90 % по сравнению с его уровнем в корме, но клетки пробиотика оставались в вегетативном состоянии на уровне 98 и 91 % для рыб в возрасте 30 и 60 дней соответственно.
карп, комбикорм для рыб, пробиотики, поведение рыб, терморезистентность, солеустойчивость, биохимические показатели
Введение
Аквакультура – быстро развивающаяся отрасль промышленности – играет важную роль в обеспечении продовольственной безопасности стран. Однако рост этой индустрии сопровождается рядом проблем, таких как увеличенная нагрузка на выращиваемые организмы и окружающую среду. Это может привести к повышенной уязвимости к вспышкам заболеваний и другим угрозам в данной сфере. Применение антибиотиков, химических веществ и вакцин стало обычной практикой в борьбе с болезнями рыб, а также для повышения роста и эффективности кормов [1].
Многолетние усилия различных исследователей проложили путь к выявлению безопасных, экономически эффективных и экологически чистых биотехнологических альтернатив для уменьшения зависимости сектора аквакультуры от антибиотиков, таких как иммуностимуляторы, пребиотики, вакцины, неспецифические усилители иммунитета, пробиотики и т. д. [1, 2].
В настоящее время в кормах для аквакультуры активно используются различные функциональные добавки. К числу наиболее распространенных и наиболее изученных относятся пребиотики и пробиотики [3]. Они применяются с целью улучшения микробиома хозяина, в первую очередь в желудочно-кишечном тракте, с последующей пользой для организма хозяина. Кишечная микробиота – это сложное сообщество, включающее бактерии, дрожжи, археи, простейшие и вирусные частицы. Эти сообщества тесно связаны со здоровьем хозяина, пищеварительной функцией и метаболизмом [4].
Пробиотики представляют собой живые полезные бактерии, которые поступают в желудочно-кишечный тракт с пищей или водой и способствуют улучшению физиологических показателей организма. Эти микроорганизмы обладают антимутагенной и антиканцерогенной активностью, участвуют в усилении иммунного ответа и защищают хозяина от вредных бактериальных и грибковых патогенов. Кроме того, все больше данных свидетельствует о взаимодействии пробиотиков с центральной нервной системой через нервные, эндокринные и иммунные механизмы, что позволяет им оказывать непосредственное влияние на функции мозга и поведение организма хозяина [3, 5, 6].
Научные исследования продемонстрировали, что пробиотики способствуют улучшению роста хозяев, укреплению иммунной системы, поддержанию здоровья кишечника и повышению выживаемости
в различных условиях. Кроме того, пробиотики увеличивают стрессоустойчивость, улучшают метаболизм и способствуют воспроизводству [7, 8].
В аквакультуре чаще всего применяются пробиотики, разработанные для теплокровных животных, поскольку существуют технологии промышленного производства многих из них. Большинство таких пробиотиков изначально выделены из млекопитающих. Однако микробиота кишечника водных животных существенно отличается от микробиоты наземных видов. Это означает, что пробиотики, разработанные для наземных животных, плохо приживаются и работают в кишечнике водных обитателей. Поэтому для аквакультуры критически важно использовать пробиотики, специально адаптированные для водных организмов [9].
Среди широкого спектра пробиотиков в аквакультуре достаточно часто обращаются к препаратам на основе рода Bacillus. Несмотря на то, что различные штаммы Bacillus spp. применяются в качестве кормовых добавок для разных животных, эффективность пробиотиков зависит от конкретного штамма. Среди пробиотиков рода Bacillus Bacillus velezensis рассматривается как перспективный пробиотик для аквакультуры благодаря своим потенциальным полезным свойствам. Ранее проведенные исследования продемонстрировали положительное влияние B. velezensis в аквакультуре, однако его применение нуждается в дальнейшем исследовании [10]. Существует предположение, что сочетание пробиотических штаммов может усиливать или дополнять полезные свойства отдельных штаммов для здоровья рыб [11]. Однако несмотря на растущий интерес к мультиштаммовым пробиотикам информации о влиянии их добавления в рацион рыб все еще недостаточно.
В связи с этим целью настоящей работы было сравнение эффективности пробиотических добавок, разработанных для животноводства и аквакультуры, при использовании их в кормах для карпов.
Материал и методы исследования
Исследования проводились в Южном научном центре Российской академии наук и Донском государственном техническом университете. Для проведения экспериментов использовалась молодь карпа (Cyprinus carpio Linnaeus, 1758). Рыбы были разделены на 3 группы: контрольную и 2 опытные.
В качестве пробиотических добавок были использованы мультиштаммовые препараты на основе бациллярных пробиотиков. Все штаммы были выделены из естественной среды обитания карпов,
а именно из донных отложений р. Дон в нижнем течении. Среди штаммов, выделенных из донных отложений, было отобрано 4 штамма, обладающих наибольшим уровнем выработки литических экзоферментов, а именно протеолитической и амилолитической активностью: Bacillus velezensis MT14, B. velezensis MT42, B. velezensis MT141, B. velezensis MT142. Дополнительно, B. velezensis MT42 и B. velezensis MT142 обладали высокой целлюлазной активностью. Штаммы были разбиты в пары так, чтобы как минимум один штамм обладал целлюлазной активностью. На основе пар штаммов были получены препараты методом твердофазной ферментации сои.
Корм для первой опытной группы включал мультиштаммовый препарат, основанный на штаммах B. velezensis MT14 и B. velezensis MT42. Конечное содержание бактерий в этом корме составило 1,9 · 106 КОЕ/г. Корм для второй опытной группы содержал мультиштаммовый препарат на основе штаммов B. velezensis MT141 и B. velezensis MT142. Конечное содержание бактерий в этом корме составило 5,0 · 106 КОЕ/г. Контрольный корм включал промышленный пробиотик на основе Bacillus (пробиотическая добавка Клостат НС SP Bacillus Subtilis PB6 (ATCC PTA-6737) с конечным содержанием бактерий 8,9 · 106 КОЕ/г. Молодь карпа средней начальной массой 2,97–3,0 г содержали в бассейнах диаметром 1,5 м, глубиной 0,7 м установки замкнутого водоснабжения. В каждый бассейн было посажено по 192 экз. молоди. Корм с содержанием 48 % протеина и 10 % жира был произведен на лабораторной установке. Норма введения пробиотического препарата – 0,05 %. Количество корма рассчитывали с помощью нормативных методов. Эффективность выращивания рыб оценивали на основании кормления в течение 120 суток.
Рост рыб оценивали по показателям абсолютного, среднесуточного приростов, скорости роста, коэффициенту массонакопления [12]. Для оценки поведенческих реакций рыб в конце эксперимента применяли методику «открытое поле» [13]. Определение жизнестойкости молоди проводили по методу функциональных нагрузок [14], тестируя по показателям терморезистентности (33 ºС) и солеустойчивости (15 ‰). Для исследования терморезистентности молоди использовали емкость объемом 25 л, заполненную водой, в которую отсаживали партию мальков в количестве 10 шт. После этого измеряли исходную температуру воды, активную реакцию среды, определяли концентрацию кислорода при помощи оксиметра. После посадки в рыбоводную емкость молодь выдерживалась в течение 1–2-х ч, после чего включали нагреватель воды. Скорость повышения температуры до сублетальной была в пределах 1 оС/ч. Для изучения солеустойчивости рыб на ранних этапах их развития использовали искусственно приготовленный солевой раствор. Выдерживание рыб осуществляли в емкости объемом 25 л. Для поддержания нормального насыщения кислорода использовали компрессорные установки с распылителями воздуха.
При содержании рыб при высокой температуре и концентрации солености наблюдали за их поведением, регистрировали время их гибели и количество погибших. В процессе выполнения эксперимента контролировали основные физико-химические параметры среды: температуру, насыщение кислорода, рН. Отбор проб и биохимический анализ (белок, жир, зола) тела рыб проводили по общепринятым методикам [15–18]. Анализ химического состава тела исследуемых рыб проводили в специализированной лаборатории, содержание жира определяли методом экстракции в аппарате Сокслета, белка – по Кьельдалю, золы – методом сжигания в муфельной печи. Для определения содержания пробиотических штаммов в кишечном содержимом рыб кишечники рыб извлекали и на льду доставляли в лабораторию. Далее кишечное содержимое извлекали в асептических условиях стерильными ножницами и лопатками и помещали в стерильные микропробирки. Готовили среднюю пробу: равное количество кишечного содержимого от 5 рыб тщательно перемешивали стерильной стеклянной палочкой либо пластиковой микробиологической петлей, затем смешивали со стерильным физиологическим раствором из расчета 1 : 10. Далее готовили ряд последовательных десятичных разведений. Посев производили на твердую питательную среду LB (Luria Bertani) дважды, до и после пастеризации. Пастеризовали суспензию при температуре 95 ºС в течение 5 мин. Чашки инкубировали при температуре 25 ºС 48 ч, затем учитывали.
Колонии пробиотических штаммов определяли по морфологическим признакам, основываясь на том, что морфология колоний разнообразна, часто индивидуальна и генетически детерминирована [19–22]. При учете использовали лабораторные чашки с соответствующими пробиотическими штаммами, находящимися в виде одиночных колоний. На чашках, высеянных из суспензии до пастеризации, учитывали общее число бацилл в кишечном содержимом. На чашках, высеянных из пастеризованной суспензии, учитывали только колонии, находящиеся в споровой форме. По разнице между полученными числами оп-
ределяли количество бацилл в вегетативной форме.
Полученные в ходе исследования результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием программного обеспечения Statistica ьи Excel. При нормальном распределении данных использовался параметрический критерий Стьюдента, при распределении, отличном от нормального – непараметрический критерий Манна – Уитни.
Результаты исследований
В условиях быстрого развития современная аквакультура испытывает недостаток в кормовых добавках, разработанных специально под ее нужды, поэтому часто в качестве пробиотических добавок используют штаммы, разработанные для животноводства и птицеводства. Но серьезные различия между рыбами и теплокровными животными (температура тела, состав кишечной микробиоты) [23] ставят под сомнения эффективность подобных добавок.
В нашем исследовании мы использовали 2 пары штаммов, обладающих высоким уровнем ферментативной активности, направленной на помощь в переваривании белков и углеводов, в том числе целлюлозы. Все штаммы были выделены из донных отложений р. Дон, т. е. были автохтонными для естественных мест обитания карпа, сталкивались с водными организмами и их микробиотой. Для сравнения мы также использовали бациллярный пробиотик, обладающий литическими свойствами, но разработанный для животноводства: КлоСТАТ, который показал себя как хороший пробиотик, увеличивающий прирост массы, снижающий конверсию корма и обеспечивающий сохранность животных в птицеводстве и свиноводстве [24–27]. Таким образом, мы использовали пробиотик из животноводства и специально разработанные для аквакультуры пробиотики с целью сравнить их эффективность.
Проведенные эксперименты по выращиванию молоди карпа на кормах, в состав которых входили экспериментальные пробиотики, выявили их эффективность. Лучшие результаты по сравнению с контролем были у особей из опытных групп (табл. 1): конечная масса была достоверно больше в 1,3–1,4 раза, абсолютный прирост на 45,53 и 32,63 %, коэффициент массонакопления на 25,81 и 19,35 %
в опыте 1 и 2 выше контроля соответственно.
Таблица 1
Table 1
Рыбоводно-биологические показатели молоди карпа
Fish-breeding and biological indicators of juvenile carp
|
Показатель |
Контроль |
Опыт 1 |
Опыт 2 |
|
Масса начальная, г |
3,00 ± 0,18 |
2,97 ± 0,22 |
2,95 ± 0,19 |
|
Масса конечная, г |
19,12 ± 0,87а, б |
26,73 ± 1,60а |
24,33 ± 1,79б |
|
Абсолютный прирост массы, г |
16,12 |
23,46 |
21,38 |
|
Среднесуточный прирост массы, г/сут |
0,13 |
0,20 |
0,18 |
|
Среднесуточная скорость роста, % |
1,6 |
1,8 |
|
|
Удельная скорость роста, % |
0,67 |
0,80 |
0,77 |
|
Коэффициент массонакопления, ед. |
0,031 |
0,039 |
0,037 |
|
Выживаемость, % |
95 |
97 |
95 |
|
Длительность эксперимента, сут |
120 |
||
*Достоверно статистически значимые различия: а – р ≤ 0,001; б – р ≤ 0,05.
Выживаемость рыб во всех группах была высокой, 95–97 %. В опытных группах улучшилось использование корма по сравнению с контрольной группой.
Наряду с исследованиями показателей роста и массонакопления был проведен анализ биохимических характеристик тела молоди (рис. 1).
Рис. 1. Биохимические показатели тканей выращиваемой молоди карпа
Fig. 1. Biochemical parameters of the tissues of the grown juvenile carp
Анализ этих показателей выявил, что молодь рыб из контрольного варианта продемонстрировала более низкое содержание жира (на 11 %) и протеина (на 4 %) по сравнению с рыбами, получавшими пробиотические добавки в опыте 1. Уровень липидов и протеина в группе «опыт 2» также был ниже, по сравнению с опытом 1, на 8,7 и 5,4 % соответственно. Эти результаты свидетельствуют о лучшем энергетическом статусе рыб из опытной группы 1, что указывает на их потенциальную способность к более быстрому и эффективному росту.
Полученные в ходе эксперимента результаты также согласуются с данными ранее проведенных исследований, которые выявили различия в содержании белка в рыбе, подвергшейся воздействию пробиотиков. Это связано с эффективным преобразованием пищи, потребляемой карпами, в структурный белок, способствующий увеличению мышечной массы. Также была замечена тенденция к росту доли жира при использовании пробиотиков, что объясняется их способностью синтезировать внеклеточные ферменты, такие как липазы. В сочетании с другими стимуляторами роста, такими как витамины, аминокислоты и жирные кислоты, пробиотики улучшают расщепление пищи и усвоение питательных веществ [28]. Это, в свою очередь, приводит к увеличению отложения белков и липидов в мышцах [29].
B. velezensis способен производить различные пищеварительные ферменты, которые способствуют разложению и агрегации белков и липидов. Однако слишком высокие дозы B. velezensis могут снизить эти положительные эффекты у рыб. Подобные результаты уже были зафиксированы в предыдущих исследованиях [30]. Результаты показали, что использование корма в опыте 2 с более высоким содержанием B. velezensis (5,0 · 106 КОЕ/г) не дало дополнительных преимуществ в активности пищеварительных ферментов и усвояемости питательных веществ. Это указывает на то, что увеличение активности пищеварительных ферментов и усвояемости питательных веществ в кишечнике карпа, вызванное внешними пробиотическими штаммами, имеет свой предел, о котором также сообщалось
в ранее проведенных исследованиях [30]. Перед широким применением необходимо тщательно оценить оптимальную дозу пробиотика, чтобы избежать нежелательных эффектов.
Штаммы, используемые нами в опытных группах, также образовывали ряд пищеварительных ферментов, позволяющих рыбам усваивать белки и углеводы. Целлюлозолитическая активность штаммов помогала получать энергию из целлюлозы, которую организм рыб не способен переварить без поддержки микроорганизмов. Помимо непосредственно источника энергии разрушение клеточных стенок компонентов растительной пищи облегчало доступ к находящимся внутри питательным веществам. Увеличение количества доступных углеводов способствовало запасанию энергии в виде липидов.
Рыбы из всех вариантов эксперимента имели схожие показатели содержания золы, что может характеризовать стабильность минерального состава при использовании различных пробиотических добавок. Это свидетельствует о том, что добавление пробиотиков не нарушает минеральный баланс в организме рыб.
Проведенный микробиологический анализ кишечного содержимого опытных групп карпа показал фактически бикультуру соответствующих пробиотических штаммов с единичными колониями других морфотипов (табл. 2).
Таблица 2
Table 2
Количество бацилл в кишечном содержимом молоди карпа разных возрастов, КОЕ/г
The number of bacilli contained in the intestinal contents of juvenile carp of different ages, CFU/g
|
Группа |
Морфотип |
Продолжительность эксперимента |
|||
|
30 дней |
60 дней |
||||
|
Вегетативная форма |
Споровая форма |
Вегетативная форма |
Споровая форма |
||
|
Контроль |
Идентичных |
7,0 ± 0,2·106 |
1,2 ± 0,2·105 |
7,3 ± 0,3·105 |
6,9 ± 0,2·104 |
|
Других |
8,8 ± 0,2·104 |
7,1 ± 0,1·104 |
7,4 ± 0,3·105 |
8,2 ± 0,2·104 |
|
|
Опыт 1 |
Идентичных MT14 + MT42 |
1,9 ± 0,2·106 |
1,2 ± 0,2·105 |
1,1 ± 0,3·106 |
3,4 ± 0,1·105 |
|
Других |
8,4 ± 0,1·105 |
8,6 ± 0,2·104 |
9,1 ± 0,1·105 |
7,6 ± 0,3·104 |
|
|
Опыт 2 |
Идентичных MT141 + MT142 |
2,6 ± 0,3·106 |
1,5 ± 0,1·105 |
1,2 ± 0,1·106 |
1,9 ± 0,2·105 |
|
Других |
7,9 ± 0,3·105 |
9,2 ± 0,1·104 |
8,8 ± 0,1·105 |
8,0 ± 0,2·104 |
|
Также в контроле наблюдалась монокультура промышленного пробиотика с единичными посторонними бациллами.
Количество пробиотических бацилл в опытных группах соответствовало количеству пробиотика в корме и составляло около половины через 30 дней эксперимента и четверти через 60 дней. Штаммы
в обоих случаях были метаболически активны. У 30-дневных рыб количество вегетативных клеток для опыта 1 и опыта 2 составило 94 и 95 %, у 60-дневных рыб – 76 и 86 % соответственно, что говорит о хорошей приживаемости пробиотика.
Количество промышленного пробиотика в кишечном содержимом снизилось на 90 % по сравнению с его количеством в корме, при этом клетки пробиотика также находились в вегетативном состоянии на 98 и 91 % для возраста 30 и 60 дней соответственно. В данном случае падение численности промышленного пробиотика было критическим – несмотря на его неоднократно описанные стимулирующие свойства [24–27], он не выживал в кишечнике рыб, а значит не был способен в полной мере эти свойства проявить. Микроорганизмы из опытных групп, приспособленные к сосуществованию с организмом рыб, не снижали численности, а значит могли в полной мере раскрыть свой пробиотический потенциал.
Следует отметить высокую обсемененность кишечного содержимого карпов видами Bacillus, а также их высокую степень разнообразия – в общей сложности было отмечено 12 и 14 морфотипов колоний естественных представителей бацилл для 30 и 60 дней соответственно. Это говорит о мощной микробиоте молоди карпов с высоким уровнем биоразнообразия.
В тесте «открытое поле» у молоди карпа из 1-й опытной группы было установлено, что ориентировочная активность оказалась достоверно (р ≤ 0,01) выше, чем в контрольной и 2-й опытной группе,
в 1,7–2 раза и составила 29,8 ед./мин (рис. 2).
Рис. 2. Результаты тестирования молоди карпа в тесте «открытое поле»:
ОА – ориентировочная активность; ФА – фоновая активность; РА1 – виброакустический низкочастотный
раздражитель; РА2 – кратковременный световой раздражитель; РА3 – постоянный световой раздражитель
Fig. 2. The results of testing of juvenile carp in the “open field” test Note: ОА – indicative activity;
ФА – background activity; РА1 – vibroacoustic low frequency stimulus;
РА2 – short-term light stimulus; РА3 – permanent light stimulus
У рыб всех групп далее отмечали снижение активности. У молоди 1-й и 2-й опытных групп фоновая активность, по сравнению с ориентировочной, была ниже на 52,35 и 46,36 %, тогда как у контрольной группы на 76,97 %. Фоновая активность рыб опытных групп была достоверно выше в 2–3,6 раза по сравнению с контролем (р ≤ 0,01). При воздействии виброакустического низкочастотного раздражителя двигательная активность увеличилась, по сравнению с фоновым уровнем, во всех группах в 1,5–3,6 раза, однако в контрольной группе реакция на неспецифический виброакустический раздражитель была наименьшей – 14,3 ед./мин. Второй раздражитель – яркая вспышка света – представляет собой неадекватный биотический фактор, который имитирует увеличение освещенности и вызывает пищедобывательную реакцию [31]. В отличие от предыдущей испуговой реакции, молодь в эксперименте снизила свою двигательную активность в 2,9–3,2 раза. В контроле молодь практически прекратила передвижение, уменьшив активность в 6,5 раз, до 2,2 ед./мин. В опытных группах этот показатель был выше, по сравнению с контролем, в 3,3–3,5 раза.
При воздействии третьего раздражителя (постоянный свет) реактивность молоди возросла в 1,5–2,3 раза в эксперименте, тогда как в контрольной группе – в 8 раз.
В контрольной группе поведение молоди было более нестабильное, что выражалось чередованием периодов сильного возбуждения и подавления активности. Это приводило к значительным колебаниям в ее реакциях на окружающую среду. Молодь из опытных групп изначально показала высокую активность в непривычных условиях, но вскоре адаптировалась, и ее реакции на изменения среды стали менее интенсивными и резкими.
Термоустойчивость молоди карпа в опытных и контрольной группах оказалась высокой. Карп адаптировался к повышенной температуре 33 ºС, и гибели молоди не было отмечено.
Жизнестойкость молоди карпа при экстремальной солевой нагрузке (15 %) оказалась наиболее высокой в 1-й опытной группе (рис. 3).
Рис. 3. Среднее время выживания молоди карпа при солевом шоке
Fig. 3. Average survival time of juvenile carp during salt shock
После кратковременного возбуждения особи, помещенные в соленую воду, успокаивались и оставались у дна или в толще воды. Постепенно у них наблюдалось увеличение частоты дыхания по сравнению с исходными показателями эксперимента. В дальнейшем было отмечено, что рыбы начали периодически подниматься к поверхности для заглатывания воздуха. Частота дыхательных движений увеличилась на фоне развивающейся аритмии, у некоторых наблюдалась потеря равновесия, а также появились мертвые особи. Среднее время выживаемости молоди в 1-й опытной группе составило 16,7 ч.
Гибель рыбы во 2-й опытной и контрольной группах началась после 4-х часов содержания в соленой воде, в 1-й опытной группе после 7-ми часов содержания (рис. 4).
Рис. 4. Показатели солеустойчивости молоди карпа
Fig. 4. Indicators of salt resistance of juvenile carp
По завершении 24-часового эксперимента было установлено, что часть молоди выжила. Наивысший уровень выживаемости наблюдался в 1-й опытной группе, он составил 30 %. При оценке качества этой молоди выяснилось, что рыбы из 1-й группы проявили большую устойчивость к повышенной солености по сравнению с рыбой из 2-й и контрольной групп, где выживаемость составила лишь 10 %.
Вызывает интерес разница показателей между двумя опытными группами. Несмотря на то, что пробиотические штаммы для данного исследования отбирались по экзоферментативной активности, не следует забывать, что бациллы способны на образование других соединений, оказывающих стимулирующее действие на различные системы организма: иммунную, нервную, гормональную [32, 33]. Они способны вырабатывать антиоксиданты, снижающие количество свободных радикалов и оксидазный стресс.
Пресноводные рыбы используют многогранный набор физиологических и молекулярных механизмов для преодоления солевого стресса, такие как изменение транспорта ионов, активация иммунной системы и белков теплового шока. Рыбы активируют белки транспорта ионов в жабрах и почках для поддержания осмотического баланса. Например, тиляпия быстро повышает экспрессию факторов транскрипции, контролирующих гены выделения соли при увеличении солености воды [34]. Одновременно активизируется иммунная система. У белого амура, подвергшегося воздействию солености, наблюдаются дисрегуляция сигнальных путей NOD-подобных рецепторов (NLR) и толл-подобных рецепторов (TLR), которые имеют решающее значение для обнаружения патогенов и иммунного ответа. Гены NLR и TLR, специфичные для рыб, играют ключевую роль в восприятии как стресса из-за солености, так и инфекций [35]. У пескарей при увеличении солености наблюдаются изменения экспрессии генов, связанных с иммунитетом, в мозговой ткани, включая сигнальные пути MAPK [36]. Белки теплового шока (HSP), такие как HSP70 и HSP7C, активируются в печени пескарей при стрессе от солености, способствуя сворачиванию белков и клеточному восстановлению [35]. Клеточная реакция на стресс (CSR) – консервативный механизм, включающий HSP и переносчики ионов – активируется у рыб, сталкивающихся с быстрыми или постепенными изменениями солености [37].
Вероятно, пробиотические бактерии B. velezensis MT14 и B. velezensis MT42, входящие в состав корма группы «опыт 1», вырабатывают некоторые из перечисленных выше веществ, стимулирующих активность иммунной системы и активизирующих белки теплового шока, что приводит к повышению устойчивости карпов к солености воды. Так, показано, что бациллы также способны активировать TLR и NLR-связанные системы у рыб [32, 33], модулировать активацию белков теплового шока [38], играющих решающую роль в устойчивости рыб к изменениям солености.
Заключение
Проведенные исследования по выращиванию молоди карпа на кормах, в состав которых входили экспериментальные пробиотики, выявили их эффективность. Показано, что лучшие результаты были
у особей из опытных групп, которые получали комбикорм с пробиотиками, включающими бактерии B. velezensis. Конечная масса была достоверно больше в 1,3–1,4 раза, абсолютный прирост на 45,53
и 32,63 %, коэффициент массонакопления на 25,81 и 19,35 % у рыб, получавших комбикорма, в состав которых входили препараты, основанные на штаммах B. velezensis MT14, B. velezensis MT42 и B. velezensis MT141, B. velezensis MT142 соответственно, по сравнению с рыбами, потреблявшими комбикорм с промышленным пробиотиком, разработанным для животноводства и содержащим B. subtilis PB6. Выживаемость рыб во всех группах была высокой, 95–97 %. Исследование состава мышечной ткани карпа, получавшего комбикорм с промышленным пробиотиком, показало, что содержание жира было на 11 % ниже, а протеина – на 4 % ниже по сравнению с рыбами, получавшими комбикорм с пробиотической добавкой со штаммами B. velezensis MT14 и B. velezensis MT42. Уровень липидов и протеина во 2-й экспериментальной группе, получавшей комбикорм с пробиотиком на основе штаммов B. velezensis MT141 и B. velezensis MT142, оказался ниже, чем в первой опытной, на 8,7 и 5,4 % соответственно. Эти результаты указывают на более высокий энергетический статус рыб из 1-й экспериментальной группы, что свидетельствует об их потенциальной способности к более быстрому и эффективному росту.
В тесте «открытое поле» у молоди карпа, которая получала в составе корма пробиотические бактерии B. velezensis MT14 и B. velezensis MT42, была зафиксирована ориентировочная активность, которая достоверно превышала таковую других групп в 1,7–2 раза, составив 29,8 ед./мин. В дальнейшем у рыб всех групп наблюдалось снижение активности. У молоди опытных групп фоновая активность оказалась ниже ориентировочной на 52,35 и 46,36 % соответственно. В контрольной группе этот показатель снизился на 76,97 % и фоновая активность составила 4 ед./мин. Фоновая активность рыб опытных групп была достоверно выше, чем у контрольной, в 2–3,6 раза. В контрольной группе у молоди наблюдались чередующиеся процессы значительного возбуждения и торможения при воздействии виброакустического и световых раздражителей.
В то же время молодь из опытных групп, сначала активно проявившая себя в новой обстановке, адаптировалась и стала менее резко реагировать на изменения окружающей среды.
Жизнестойкость молоди карпа при экстремальной солевой нагрузке была наивысшей в 1-й опытной группе, получавшей комбикорм, включающий препарат, основанный на штаммах B. velezensis MT14
и B. velezensis MT42. Среднее время выживания составило 16,7 ч, а уровень выживаемости – 30 %.
Показано, что количество активных пробиотических микроорганизмов в кишечниках рыб опытных групп значительно превышает аналогичный показатель в контрольной группе.
Количество пробиотических бацилл в кишечнике рыб опытных групп соответствовало уровню пробиотика в корме и составляло около 50 % после 30 дней эксперимента и 25 % после 60 дней. В обоих случаях штаммы оставались метаболически активными. У рыб после выращивания в течение 30 дней доля вегетативных клеток составила 94–95 %.
У рыб, находившихся на 60-дневном этапе, эти показатели составили 76–86 %, что свидетельствует о высокой приживаемости пробиотика.
В контрольной группе количество промышленного пробиотика в кишечном содержимом рыб уменьшалось на 90 % по сравнению с его уровнем в корме, тем не менее клетки пробиотика оставались в вегетативном состоянии на 98 и 91 % для рыб в возрасте 30 и 60 дней соответственно.
Полученные результаты связаны с литической активностью использованных нами штаммов. Протео-, амило- и целлюлозолитические ферменты, вырабатываемые штаммами, помогали молоди карпов в переваривании компонентов кормов, что увеличивало доступность и усвояемость питательных веществ. На этом основан лучший рост и адаптивность рыб из опытных групп.
Полученные результаты подчеркивают эффективность специально разработанных для аквакультуры штаммов пробиотика по сравнению с пробиотиком, эффективным в животноводстве и птицеводстве. Данные штаммы могут использоваться как средство для улучшения качества выращиваемых рыб и служить основой для дальнейшего развития этого направления в аквакультуре. Исследования подчеркивают потенциал пробиотиков, выделенных из естественных мест обитания рыб, для повышения продуктивности и устойчивости рыб к стрессовым факторам, что в конечном итоге способствует улучшению качества выращиваемых рыб.
1. Suguna T. Role of Probiotics in Aquaculture // Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci. 2020. V. 9 (10). P. 143–149.
2. Shinde S. V., Sawant Sh., Rathod S., Patekar P., Sheikh S., Narsale S., Tekam I., Limbola M. Unlocking the potential: A comprehensive review on the application of probiotics in aquaculture // International Journal of Advanced Biochemistry Research. 2024. V. 8. N. 3S. P. 168–173.
3. Amenyogbe E., Droepenu E. K., Ayisi Ch. L., Boamah G. A., Duker R. Q., Abarike E. D., Huang J. Sh. Impact of probiotics, prebiotics, and synbiotics on digestive enzymes, oxidative stress, and antioxidant defense in fish farming: current insights and future perspectives // Frontiers in Marine Science. 2024. V. 11. URL: https://doi.org/10.3389/fmars.2024.1368436 (дата обращения: 12.12.2024).
4. Меррифилд Д. Роль пробиотиков в улучшении пищеварения у рыб // Комбикорма. 2017. № 9. С. 112–114.
5. Пономарева Е. Н., Григорьев В. А., Гуляева А. Ю., Мазанко М. С., Празднова Е. В., Чистяков В. А., Рудой Д. В., Брень А. Б., Сорокина М. Н., Иванов Ю. А. Влияние кормов с пробиотиками на рост, развитие и поведенческие реакции карпа Cyprinus carpio, стерляди Acipenser ruthenus и бестера Huso Huso × Acipenser ruthenus // Наука Юга России. 2024. Т. 20. № 2. С. 83–90.
6. Cryan J. F., Dinan T. G. Mind-altering microorgan-isms: the impact of the gut microbiota on brain and behav-iour // Nature Reviews Neuroscience. 2012. V. 13 (10). P. 701‒712.
7. Ponomareva E. N., Sorokina M. N., Grigoriev V. A., Mazanko M., Chistyakov V. A., Rudoy D. V. Probiotic Bacillus amyloliquefaciens B-1895 improved growth of juvenile // Food Science of Animal Resources. 2024. V. 44. N. 4. P. 805–816.
8. Конькова А. В., Файзулина Д. Р., Ширина Ю. М., Богатов И. А. Влияние кормовой пробиотической добавки «Ветоспоринж» (Bacillus subtilis) и минеральной добавки «Цеолит» (опока) на проявление генотоксических эффектов в клетках крови молоди стерляди (Acipenser ruthenus) в условиях аквакультуры // Вестн. Астрахан. гос. техн. ун-та. Сер.: Рыбное хозяйство. 2024. № 2. С. 90–100.
9. Hao Q., Olsen R. E., Ringø E., Ding Q., Teame T., Yao Y., Ran C., Yang Y., Zhang Z., Zhou Z. Dietary Solid-state-fermentation product of Bacillus velezensis T23 alleviate hepatic steatosis, oxidative stress, gut barrier damage, and microbiota dysbiosis in juvenile genetically improved farmed tilapia (GIFT, Oreochromis niloticus) // Aquaculture Reports. 2025. V. 40. P. 102523
10. Khalid F., Khalid A., Fu Y., Hu Q., Zheng Y., Khan S., Wang Z. Potential of Bacillus velezensis as a probiotic in animal feed: a review // J. Microbiol. Jul. 2021. V. 59 (7). P. 627–633.
11. Shadrack R. S., Manabu I., Yokoyama S. Efficacy of single and mix probiotic bacteria strain on growth indices, physiological condition and bio-chemical composition of juvenile amberjack (Seriola dumerili) // Aquaculture Reports. 2021. V. 20. P. 100753.
12. Щербина М. А., Гамыгин Е. А. Кормление рыб в пресноводной аквакультуре. М.: Изд-во ВНИРО, 2006. 360 с.
13. Никоноров С. И., Витвицкая Л. В. Эколого-генетические проблемы искусственного воспроизводства осетровых и лососевых рыб. М.: Наука, 1993. 254 с.
14. Лукьяненко В. И., Касимов Р. Ю., Кокоза А. А. Возрастно-весовой стандарт заводской молоди каспийских оcетровых: экспериментальное обоснование. Волгоград: Изд-во ИБВВ АН СССР, 1984. 229 с.
15. ГОСТ ISO 5983-2-2016. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение массовой доли азота и вычисление массовой доли сырого протеина. Ч. 2. Метод с использованием блока озоления и перегонки с водяным паром. URL: https://www.gostinfo.ru/catalog/Details/?id=6260226 (дата обращения: 27.10.2024).
16. ГОСТ 13496.15-2016. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения массовой доли сырого жира. URL: https://internet-law.ru/gosts/gost/63036/?ysclid=m2tcwol2oo58523756 (дата обращения: 27.10.2024).
17. ГОСТ 26226-95. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения сырой золы. URL: https://internet-law.ru/gosts/gost/9294/?ysclid=m2tc97robk330738365 (дата обращения: 27.10.2024).
18. ГОСТ 32045-2012. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания золы, не растворимой в соляной кислоте. URL: https://internet-law.ru/gosts/gost/55206/?ysclid=m2tccpfj7n351219435 (дата обращения: 27.10.2024).
19. Li J., Wu J., Wang J., Wang X. Phenotypic variations induced emergence of orientation order and morphology in Bacillus subtilis biofilm growth // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2023. V. 686. P. 149198.
20. Li X., Kong R., Wang J., Wu J., He K., Wang X. The formation mechanism of Bacillus subtilis biofilm surface morphology under competitive environment // Can. J. Microbiol. 2023. V. 69 (7). Р. 251–261.
21. Wang X., Kong Y., Zhao H., Yan X. Dependence of the Bacillus subtilis biofilm expansion rate on phenotypes and the morphology under different growing conditions // Dev. Growth. Differ. 2019. V. 61 (7-8). Р. 431–443.
22. Wang J., Li X., Kong R., Wu J., Wang X. Fractal morphology facilitates Bacillus subtilis biofilm growth // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2022. V. 29 (37). Р. 56168–56177.
23. Rawls J. F., Mahowald M. A., Ley R. E., Gordon J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection // Cell. 2006. V. 127. N. 2. P. 423–433.
24. Хохрин С. Н., Волкова И. И. Использование пробиотика Клостат в рационах птицы и влияние его на сохранность и продуктивность курнесушек // Изв. Санкт-Петербург. гос. аграр. ун-та. 2013. № 32. С. 78–85.
25. Проскурина Л. И., Подвинская Е. А. Применение пробиотика Клостат в рационе поросят // Вестн. Инновац. Евразийс. ун-та. 2018. № 2 (70). С. 50–54.
26. Капитонова Е. А., Мехова О. С. Применение пробиотика «КлоСТАТ ТМ сухой» в бройлерном птицеводстве // Уч. зап. учреждения образования «Витебская ордена «Знак почета» гос. акад. ветеринар. медицины». 2015. Т. 51. Вып. 1 (1). С. 208–212.
27. Хохрин С. Н., Пристач Л. Н., Волкова И. И. Влияние пробиотика Клостат в чистом виде и в сочетании с Салмонилом на качество яиц кур // Изв. Санкт-Петербург. гос. аграр. ун-та. 2015. № 38. С. 54–59.
28. Саврасова Н. П., Семенова Е. В., Михайлов Е. В., Мармурова М. А. Влияние пробиотика «Бацелл-М» на химический состав мышечной и костной ткани карпа обыкновенного Cyprinus carpio // Технологии и товароведение сельскохозяйственной продукции. 2024. № 3 (26). С. 18–25.
29. Guo M., Meng L., Li F., Liu Y., Zhang Z., Zhang Q., Kong W. Effects of dietary Bacillus pumilus on the growth, intestinal health, lipid metabolism, and mTOR signaling pathway of juvenile coho salmon (Oncorhynchus kisutch) // Water Biology and Security. 2025. V. 4. Iss. 1. Р. 100313.
30. Ji Zh., Lu X., Xue M., Fan Y., Tian J., Dong L., Zhu Ch., Wen H., Jiang M. The probiotic effects of host-associated Bacillus velezensis in diets for hybrid yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco ♀ × Pelteobagrus vachelli ♂) // Animal Nutrition. 2023. V. 15. P. 114–125.
31. Сорокина М. Н., Ковалева А. В., Пономарева Е. Н. Результаты адаптации молоди судака Sander lucioperca (Linnaeus, 1758) к выращиванию в индустриальных условиях // Вестн. Астрахан. гос. техн. ун-та. Сер.: Рыбное хозяйство. 2009. № 2. С. 95–101.
32. Dang Y., Sun Y., Zhou Y., Men X., Wang B., Li B., Ren Y. Effects of probiotics on growth, the toll-like receptor mediated immune response and susceptibility to Aeromonas salmonicida infection in rainbow trout Oncorhynchus mykiss // Aquaculture. 2022. V. 561. Р. 738668.
33. Li F., Xie Y., Guo M., Liu Y., Tong T., Zhang Q., Kong W. Effects of dietary Bacillus cereus supplementation on the growth performance, serum physiology and biochemistry, Nrf2, TLR/NF-κB signaling pathways, and intestinal health of juvenile coho salmon (Oncorhynchus kisutch) // Aquaculture Reports. 2024. V. 36. Р. 102177.
34. Kültz D. Physiological mechanisms used by fish to cope with salinity stress // The Journal of experimental biology. 2015. V. 218 (12). Р. 1907–1914.
35. Fang H., Yang Y. Y., Wu X. M., Zheng S. Y., Song Y. J., Zhang J., Chang M. X. Effects and Molecular Regulation Mechanisms of Salinity Stress on the Health and Disease Resistance of Grass Carp // Front. Immunol. 2022. V. 13. Р. 917497.
36. Escobar-Sierra C., Cañedo-Argüelles M., Vinyoles D., Lampert K. P. Unravelling the molecular mechanisms of fish salinity adaptation in the face of multiple stressors: A comparative multi-tissue transcriptomic study in the Llobregat River, Barcelona, Spain // bioRxiv. 2023. V. 11. Р. 49.
37. Evans T. G., Kültz D. The cellular stress response in fish exposed to salinity fluctuations // Journal of Experi-mental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 2020. V. 333 (6). P. 421–435.
38. Elbahnaswy S., Elshopakey G. E., Abdelwarith A. A., Younis E. M., Davies S. J., El-Son M. A. Immune protective, stress indicators, antioxidant, histopathological status, and heat shock protein gene expression impacts of dietary Bacillus spp. against heat shock in Nile tilapia, Oreochromis niloticus // BMC Veterinary Research. 2024. V. 20 (1). Р. 469.
