Russian Federation
The assessment of the quality of sea water samples was carried out according to biological indicators - the total number of microorganisms, which react sharply to changes in their environment. To ensure control over the ecological state of the aquatic environment, it is necessary to conduct regular monitoring studies on such microbiological indicators as the total number of microorganisms. Conventional microbiological methods for determining the total number of microorganisms are laborious and require a well-equipped laboratory and qualified personnel, and such analysis usually takes 24-48 hours. For a comparative assessment of the quality of sea water samples, the number of microorganisms was recorded by traditional methods and by the express method of chemiluminescence. As traditional methods, the method of inoculation on nutrient media, counting on a fluorescent microscope and on colored membrane filters were chosen. A chemiluminescent method was chosen for the rapid assessment of water by the total microbial abundance, which makes it possible to measure the content of bacterial cells by their ATP content. It is shown that the chemiluminescent method is superior to traditional methods for determining the total bacterial contamination (TBC, one of the main indicators of the natural object quality). At the same time, the chemiluminescent reaction made it possible to significantly reduce the measurement time and speed up data processing (measurement time did not exceed 2.5 min), i.e., it became possible to quickly analyze the samples under study in the field and in mobile laboratories. Direct positive correlations between the data determined by the traditional and new methods are revealed. The results obtained in the framework of a study on the determination of the number of microorganisms by classical methods and the chemiluminescence method allow us to recommend their use for express assessment of the quality of various natural objects.
water quality, microorganisms, water samples, total number of bacteria, inoculation method, filter method, chemiluminescent express method
Актуальной темой экологических исследований в последние годы является изучение изменений состояния природных объектов под влиянием антропогенного пресса, которому они подвергаются. Эта проблема особенно затрагивает водные экосистемы, которые являются одними из самых чув-ствительных элементов в природе [1]. Нарастающее активное использование биологических ресурсов Северного Каспия требует комплексного кон-троля за состоянием акватории уникального водоема. Одним из важнейших направлений является проведение ежегодных исследований качества морской микробиоты [2]. Микроорганизмы экосистемы Каспийского моря гораздо быстрее реагируют на изменения условий окружающей среды, такие как преобразование запасов азота, изменение температуры, солености и количества загрязняющих веществ. Высокая уязвимость морского бактериального сообщества позволяет использовать его компоненты для оценки качества воды и определения уровня воспринимаемой антропогенной нагрузки путем изменения различных характеристик микробиологических сообществ [3]. Общепринятые традиционные методы микробиологического исследования не позволяют проводить оценку в режиме реального времени, т. к. продолжительность исследования составляет от 24–48 ч до нескольких суток. Кроме того, проводимые этими методами анализы длительны, и для их выполнения требуется наличие специально оборудованных помещений и квалифицированного персонала, в результате анализа появляется большое количество потенциально опасных биологических отходов, которые необходимо утилизировать [4]. В связи с вышеперечисленными факторами на практике все чаще внедряются косвенные методы определения общей микробной популяции, называемые также экспресс-методами. Данные методы микробиологического анализа определяют в исследуемых образцах природных объектов такие физико-химические параметры, абсолютное значение или изменение которых соответствует количеству микробных клеток в образце. Одним из наиболее совершенных методов можно назвать экспресс-метод хемилюминесценции, который основан на определении содержания аденозин-5'-трифосфата (АТФ) микробных клеток в исследуемом образце, пропорционального количеству самих клеток [5]. Хемилюминесцентный метод применялся для оценки качества проб речной воды, пищевых продуктов, оборудования и сырья в производстве [6, 7]. Таким образом, реальной проблемой является поиск новых методов определения качества водной среды. Первоначальная гипотеза состоит в том, что экспресс-метод хемилюминесценции позволит значительно быстрее и эффективнее проводить экологический мониторинг морской воды. Целью работы являлась оценка экологического состояния проб воды Северного Каспия по общей численности микроорганизмов с использованием традиционных методов и хемилюминесцентного экспресс-метода. Пробы отбирались в соответствии со стандартизированной методикой в октяб-ре 2021 г. Карта точек отбора проб 1–4 представ-лена на рис. (температура воды равна в точке № 1 13,5 °C; в точке № 2 12,9 °C; в точке № 3 13 °C; в точке № 4 13,6 °C). Карта точек отбора проб: точка № 1– кв. 292; точка № 2 – кв. 350; точка № 3 – кв. 402/403; точка № 4 – кв. 297 Sampling points map: Point No. 1 - Cell 292; Point No. 2 - Cell 350; Point No. 3 - Cell 402/403; Point No. 4 - Cell 297 Материал и методы исследований В пробах воды общую численность микроорганизмов, относящихся к сапротрофным мезофиллам, определяли путем посева соответствующих разведений на питательный агар. Численность микроорганизмов группы сапротрофных мезофиллов определяли методом глубинного посева в чашки Петри на мясо-пептонный агар в 2-х повторностях под стерильным контролем и термостатированием при 37 °С в течение 24 ч [8]. Общую численность мик-роорганизмов определяли с помощью люминесцентной микроскопии, для чего взвесь исследуемой воды микропипеткой наносили на обезжиренное предметное стекло (0,01 мл на препарат) и распре-деляли на площади 4 см2 (2 × 2 см). Препарат фик-сировали нагреванием в пламени спиртовки и окрашивали водным раствором акридинового оранжевого (разведение 1 : 10 000, 2–4 мин). Для удаления остатков красителя стекла оставляли в стакане с водопроводной водой на 10 мин. Препараты высушивали при комнатной температуре и подсчитывали бактериальные клетки в люминесцентном микроскопе (ЛЮМАМ-11) [9]. Общую численность микроорганизмов определяли методом прямой микроскопии мембранных фильтров, для чего определенный объем исследуемой пробы воды фильтровали на мембранных фильтрах с размером пор 0,45 мкм. Далее микроорганизмы, содержащиеся на фильтрах, окрашивали карболовым эритрозином и подсчитывали в 20 полях зрения с помощью микроскопа, оснащенного сетчатым микрометром [10]. В качестве экспресс-метода определения общей численности микрооганизмов воды выбран люциферин-люциферазный хемилюминесцентный метод с использованием люминометра ЛЮМ-1. Реактивы Lumtek использовались для определения общего количества бактериальных клеток в образце воды на основе количества содержащегося в нем внутриклеточного АТФ. Из пробы испытуемой воды отбирали 0,3 мл, заливали в фильтравету и проталкивали поршнем так, чтобы жидкость впиталась в картон. На следующем этапе фильтравету переносили в кюветное отделение люминометра, добавляли 0,02 мл контрольного реагента АТФ, а через 2 минуты приливали 0,1 мл раствора реагента АТФ. Далее сигнал биолюминесценции исследуемого образца сразу регистрировался [11]. Для статистической обработки данных коэффициент корреляции рассчитывали в программе Microsoft Excel. Выбранный показатель используется для нахождения связи между двумя исследуемыми свойствами: если найденное значение (r) близко к 1, это свидетельствует о наличии тесной связи, а если ближе к 0, то о ее отсутствии. Результаты исследования и их обсуждение Для установления соответствия результатов анализа проб воды, полученных экспресс-методом и общепринятыми методами, параллельно проводили прямой микробный учет на люминесцентном микроскопе и на окрашенных мембранных фильтрах. Полученные результаты представлены в таблице. Оценка общей численности микроорганизмов проб воды Северного Каспия Assessment of the total number of microorganisms of water samples in the Northern Caspian № пробы Показатели численности микроорганизмов, тыс. КОЕ/мл Прямой счет люминесцентным методом Сапротрофы, методом посева Общая численность бактерий, методом фильтров Численность бактерий, хемилюминесцентным методом 1 22 2,3 560 53 2 42 6,2 580 15 3 3,4 1,7 620 2,2 4 28 51 410 12 По результатам прямого счета общая численность микроорганизмов находилась в пределах 3,4–42 тыс. КОЕ/мл, численность сапротрофных бактерий – от 1,7 тыс. КОЕ/мл до 51 тыс. КОЕ/мл. Численность микроорганизмов, определенная экс-пресс-методом, составила от 2,2 до 53 тыс. КОЕ/мл. Общая численность микроорганизмов, полученная с помощью метода прямого микроскопирования мембранных фильтров, достигла 410–620 тыс. КОЕ/мл. Согласно требованиям ГОСТ 17.1.2.04–77 «Охрана природы. Гидросфера. Показатели состояния и правила таксации рыбохозяйственных водных объектов» исследуемые пробы воды относятся к чистым водам по показателю общей численности микроорганизмов, т. к. определенная методом прямого счета численность составила менее 0,5 млн кл./мл. По численности сапротрофных микроорганизмов исследуемые воды можно отнести к чистым (точки № 1, № 3), загрязненным (точка № 2) и грязным (точка № 4). Результаты, полученные в ходе исследования, позволили установить прямые положительные корреляционные связи между данными об общей численности микроорганизмов, полученными общепринятыми методами и методом хемилюминесценции. Однако наиболее значимая корреляция численности микроорганизмов установлена между хемилюминесцентным методом и методом прямого учета (r = +0,9). Высокий коэффициент корреляции позволяет рекомендовать хемилюминесцентный метод в качестве альтернативы методу прямого учета, т. к. ошибка, возникающая из-за человеческого фактора при пробоподготовке и анализе на люминесцентном микроскопе, сводится к минимуму, т. к. исключаются поспешная регистрация или про-смотр недостаточного количества полей зрения. Рассчитанный высокий коэффициент корреляции обусловлен тем, что при подсчете на люминесцентном микроскопе учитываются все живые клетки, а при хемилюминесцентном методе общее количество живых микроорганизмов определяется по содержанию АТФ в их клетках. Традиционные методы микробиологии, использованные в данной работе, не позволяют получить данные о загрязнении водоема. Например, процесс посева имеет ряд недостатков. Во-первых, это значительное время его осуществления. Этот аспект особенно важен для контроля качества водоподготовки, где бактериологические методы контроля применяются действительно ретроспективно. Также существенным является объем работы, связанной с обеспечением проведения анализа и, прежде всего, с такими основными этапами, как подготовка, стерилизация, розлив и хранение готовых к использованию сред. Также на искусственных питательных средах культивируются не все виды микроорганизмов, а только те, которые способны поглощать питательные вещества, содержащиеся в питательной среде, и расти в предлагаемых условиях. Метод прямого подсчета с использованием флуорохромов не исключает ошибки, связанной с квалификацией специалиста, проводящего этот анализ. Также метод определения общей численности на мембранных фильтрах не может дать достоверной информации о микро-биологическом загрязнении объекта, т. к. часто обнаруживаются остатки, которые отпечатываются на смывах, окрашенных красителями. Все же эти остатки можно различить исходя из морфологии клеток микроорганизмов при большем увеличении, что требует дополнительного времени и специальной подготовки. Данные, полученные экспресс-методом хемилюминесценции, дают точную оценку качества воды за короткое время (в среднем на анализ пробы уходило около одной минуты). Все более широкое распространение получает хемилюминесцентный метод определения общей численности микроорганизмов, основанный на обнаружении присутствующего в их клетках АТФ, который позволил быстро определить состояние проб морской воды. Для оценки качества различных объектов с помощью этого экспресс-метода не требуется дорогостоящего оборудования или трудоемкой пробоподготовки, а сам анализ можно проводить непосредственно в местах отбора проб. Вся процедура состоит из трех этапов: пробоподготовка, исключающая мешающее влияние матрицы пробы, аналитическая реакция и обработка полученного сигнала. Выполнение хемилюминесцентного анализа сводит к минимуму ошибки, которые могут возникнуть при отборе проб, транспортировке, хранении и обработке. Использование метода быстрой хемилюминесценции не приводит к образованию большого количества опасных отходов по сравнению с традиционными методами анализа. Заключение Таким образом, проведенная сравнительная оценка качества морских вод хемилюминесцентным и традиционными методами обосновывает применение экспресс-методов для оценки качества воды по биологическим показателям. Исходная гипотеза о возможности оценки качества морской воды хемилюминесцентным методом подтверждена наличием прямой положительной корреляционной связи. Установлено, что исследованные пробы воды относятся к чистым по общему количеству микроорганизмов и к чистым, загрязненным и грязным – по количеству сапротрофных микро-организмов. Быстрота, простота анализа, экологичность и возможность непосредственного использования в точках отбора проб позволяют рекомендовать хемилюминесцентный метод в качестве альтернативы существующим традиционным методам исследования качества воды в различных водоемах. Однако при необходимости выделения и изучения микроорганизмов традиционный метод посева можно использовать как дополнительный.
1. Babkina I. V., Koren'kov V. A. Vodoohrannye zony kak odin iz sposobov upravleniya ekologicheskim sostoyaniem vodnyh ob'ektov Krasnoyarskogo kraya // Problemy ispol'zovaniya i ohrany prirodnyh resursov Central'-noy Sibiri. 2001. S. 189-192.
2. D'yakova S. A., Soprunova O. B., Galyautdinova E R., Men'kova A. V., Baubekova D. G., Proskurina V. V., Lardygina E. G., Galkina Yu. V., Degtyareva L. V., Chehomov S. P. Sostoyanie bakterioplanktona Severnogo Kaspiya v sovremennyh usloviyah // Vestn. Astrahan. gos. tehn. un-ta. Ser.: Rybnoe hozyaystvo. 2021. № 4. S. 31-38.
3. Bazhenova T. V. Ekologicheskaya bezopasnost' vodno-kanalizacionnogo hozyaystva strany // Sb. materialov VIII Mezhdunar. nauch.-prakt. konf. Penza, 2005. S. 132-135.
4. Tymchuk S. N., Larin V. E. Sovremennye tehnologii v tradicionnyh mikrobiologicheskih issledovaniyah // Voda Magazine. 2012. № 5 (57). URL: https://watermagazine.ru/analitika/obzori/24471-sovremennye-tekhnologii-v-traditsionnykh-mikrobiologicheskikh-issledovaniyakh.html (data obrascheniya: 12.02.2021).
5. Miheeva I. V., Trofimov S. I., Haritonova Yu. S. Mikrobiologicheskoe issledovanie hemilyuminescentnym ekspress-metodom antropogennogo zagryazneniya reki Shodnya // Nauchnye i obrazovatel'nye problemy grazhdanskoy zaschity. 2011. № 1. S. 31-37.
6. Frundzhyan V. G., Ugarova N. N. Bystrye metody kontrolya mikrobiologicheskoy chistoty v pischevoy promyshlennosti // Pisch. prom-st'. 2008. № 4. S. 22-23.
7. Lesovskaya M. I., Igoshin A. S. Ekspress-ocenka kachestva meda s pomosch'yu hemilyuminescentnogo analiza // Mezhdunar. nauch.-issledovat. zhurn. 2020. № 8. S. 87-93.
8. GOST 31942-2012. Voda. Otbor prob dlya mikrobiologicheskogo analiza. M.: Standartinform, 2013. 27 s.
9. GOST 17.1.2.04-77. Ohrana prirody. Gidrosfera. Pokazateli sostoyaniya i pravila taksacii rybohozyaystvennyh vodnyh ob'ektov. M.: Gos. kom. SSSR po standartam, 1977. 27 s.
10. Netrusov A. I. Praktikum po mikrobiologii. M.: Akademiya, 2005. 608 s.
11. Soprunova O. B. Metody biolyuminescentnoy ATF-metrii. Astrahan', 2017. 35 s.
