Russian Federation
Russian Federation
Russian Federation
Nowadays bacteriophages are widely used in veterinary medicine, bio-technology, agriculture and in particular in aquaculture. Narrow specificity affecting the bacterial microflora and selective influence on the pathogenic and opportunistic microorganisms allow using the bacteriophages for diagnosing, preventing and treating the diseases of farm animals and fish. The emergence of antibiotic-resistant strains of microorganisms involves the search for new drugs to combat them. In this regard, phage therapy is an alternative to antimicrobial treatment of bacterial diseases of animals and fish. Despite the lack of data on the bacteriophage-based drugs applications in aquaculture, this direction is found to be promising and relevant. There is given a comparative analysis of the microbiocenosis of the gills and intestines of two-year-olds of red tilapia farmed in the water with adding the poly-valence pyobacteriophage and fed by compound feed treated by the preparation. It has been found that the dominant position in the intestinal microbiocenosis of red tilapia belongs to Micrococcus bacteria, whose share made 45.7% of all isolates of the gastrointestinal tract. By the frequency of occurrence, the second place is taken by the Bacterium species (33.2%), the third place - Staphylococcus (16.1%) species. The remaining groups of intestinal microorganisms are presented by a significantly number of isolates. It has been stated that the gills microflora was represented by a smaller species composition compared to the digestive tract microbiota. Isolates of the Bacterium and Staphylococcus bacteria were dominating, while the Actinomycetales and Bacillus microorganisms were represented in smaller numbers (1-2 colonies). The addition of a bacteriophage to water and its processing of compound feed helps to reduce the contamination of gills and reduce pathogenic microflora in the intestines of fish.
microbiocenosis, intestines, gills, red tilapia, bacterial isolates, bacteriophage
Введение В настоящее время наблюдается растущая тенденция к использованию препаратов на основе бактериофагов в аквакультуре, которая терпит большие убытки из-за роста инфекционных заболеваний. При использовании бактериофагов необходимо уделять внимание их специфичности, бактериальной устойчивости, безопасности, а также их влиянию на качество состава микробиоценоза рыб [1, 2]. Микробиоценоз рыб играет немаловажную роль в обеспечении защитных функций организма и регуляции процессов пищеварения. Установлено, что бактерии продуцируют различные антибактериальные вещества, препятствуя колонизации кишечника патогенными микроорганизмами. Поверхность рыбы может быть обсеменена спорообразующими и неспорообразующими бактериями, кокками, актиномицетами, дрожжами и плесневыми грибами. Наиболее обсеменены микроорганизмами жабры и кишечник рыб. Высокая обсемененность жабр обусловлена высоким содержанием органических веществ, находящихся в воде, ее интенсивной аэрацией и слабощелочной реакцией. Кишечная микрофлора рыб характеризуется повышенным содержанием патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, служащих источником различных инфекционных заболеваний [3]. Среди микробиоты кишечника встречаются все микроскопические обитатели воды, а также анаэробные бактерии, наиболее распространенными среди которых являются патогенные клостридии и кишечные палочки [4]. Микробиота пищеварительного тракта рыб подразделяется на главную (основная, автохтонная, облигатная) и остаточную (транзитная, факультативная, аллохтонная). Главная микрофлора представлена анаэробами – бифидобактериями, лактобактериями, бактероидами, фузобактериями (90 %), и аэробами – кишечной палочкой, энтерококками (9 %), поддерживающими колонизационную резистентность слизистой кишечника к контаминации условно-патогенными микроорганизмами. Остаточная микрофлора представлена не более чем 1 % сапрофитов (стафилококки, грибы) и условно-патогенных микроорганизмов (гемолитический стрептококк, золотистый стафилококк, грамотрицательные палочки), которые также являются составной частью кишечного биотопа. Отделы желудочно-кишечного тракта рыб характеризуются неодинаковой численностью бактерий. Наибольшее их количество обнаружено в переднем и среднем отделах, что может свидетельствовать об участии микроорганизмов в расщеплении питательных веществ. Наличие большого числа бактерий в заднем отделе кишечника может быть связано с их участием в расщеплении балластных веществ и с обеспечением рыб вторичными нутриентами [5]. Цель исследований – изучить качественный состав микробиоценоза жабр и кишечника двухгодовиков красной тиляпии при выращивании с применением современных бактериофагов. Материал и методы исследований Экспериментальные исследования проводились в Инновационном центре «Биоаквапарк – НТЦ аквакультуры» (ФГБОУ ВО «Астраханский государственный технический университет»). В качестве объектов исследований были использованы двухгодовики красной тиляпии (Oreochromis mossambicus × O. niloticus). Выращивание рыб осуществлялось в аквариумах объемом 400 л с плотностью посадки 25 экземпляров на аквариум. Температура воды поддерживалась на уровне 23,5–26,5 °С, при этом содержание кислорода не опускалось ниже 6,2 мг/л. Для проведения экспериментальных исследований был использован пиобактериофаг поливалентный очищенный (Pyobacteriophagum polyvalen- tum purum), представляющий собой смесь стерильных очищенных фильтратов фаголизатов бактерий Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli. Длительность эксперимента составила 14 суток. Для этого двухгодовики красной тиляпии были разделены на две опытные группы и контрольную: в первой опытной группе рыб выращивали в воде с добавлением пиобактериофага в концентрации 1 мл/л воды, во второй – с добавлением пиобактериофага в концентрации 1 мл/л воды и обработкой препаратом комбикорма из расчета 5 мл на суточную норму кормления. Кратность введения бактериофага составила 1 раз в сутки в течение 14 дней. Суточная норма кормления определялась в соответствии с массой тела рыб и температурой воды согласно общепринятой технологии выращивания [6]. Для микробиологических исследований был проведен анализ количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (кМАФАнМ) в соответствии с ГОСТ110444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов». Пробы для микробиологического анализа отбирали стерильным инструментом в стерильную посуду, закрытую двумя слоями бумаги, и упаковывали в стерильную бумагу. Из подготовленной навески готовили необходимые разведения в соответствии с СанПиН 12.3.2.1078-01. Затем из необходимого разведения по 1 мл делали посевы в две параллельные чашки Петри. Посевы заливали одной из агаризованных сред: мясопептонный агар (МПА), Сабуро – с целью выделения бактерий группы кишечной палочки и определения наличия дрожжей и плесневых грибов (рис. 1). Рис. 1. Посевы с жабр и кишечника тиляпии на питательные среды МПА и Сабуро Fig. 1. Inoculation of tilapia gills and intestine to the meat-peptone agar and Sabouraud's agar media Посевы инкубировали в термостате при температуре 30 °С в течение 72 часов. После инкубирования считали количество колоний и анализировали в соответствии с требованиями СанПиН12.3.2.1078-01. Выделенные бактерии идентифицировали до рода по определителям Берджи [7]. Результаты исследований В ходе экспериментальных работ был проведен качественный анализ микрофлоры жабр и кишечника двухгодовиков красной тиляпии, выращиваемой с применением пиобактериофага поливалентного. За время проведения экспериментальных исследований в жабрах рыб на среде МПА были высеяны микроорганизмы со следующими культуральными свойствами: колонии округлые, маленького и среднего размера, кремового цвета, с неровными краями; колонии светло-коричневого цвета неоднород- ной структуры; колонии округлые, средние по размеру, молочно-коричневого цвета, с ровными краями; колонии округлые, среднего размера, молочного цвета, с ровными краями (табл. 1). Таблица 1 Table 1 Культурально-морфологическая характеристика кМАФАнМ жабр красной тиляпии на среде МПА Cultural and morphological characteristics of qMAFAnM of red tilapia gills on MPA medium Группа Число колоний Культуральные свойства колоний Морфологические свойства клеток Предположительно род Опытная 1 6 Округлые, маленького и среднего размера, кремового цвета, с неровными краями, выпуклые, гладкие колонии Г+, неспорообразующие палочки Bacterium Опытная 2 1 Сплошной рост колонии, светло-коричневого цвета, неоднородная структура Г+, образование ветвящегося мицелия Actinomycetales 2 Округлые, средние по размеру, молочно-коричневого цвета, с ровными краями, плоские, гладкие колонии Г+, неспорообразующие палочки Bacillus Контрольная 1 Округлая, среднего размера, молочного цвета, с ровными краями, выпуклая, гладкая колония Г+, неспорообразующие и Г+, спорообразующие палочки Bacterium Среди вышеперечисленных колоний были выявлены грамположительные спорообразующие и неспорообразующие палочки р. Bacterium, грамположительный ветвящийся мицелий р. Actinomycetales, грамположительные неспорообразующие палочки р. Bacillus (рис. 2). а б в г Рис. 2. Микроскопия бактерий, выделенных из жабр красной тиляпии (среда МПА): а – р. Bacterium; б – р. Actinomycetales; в – р. Bacillus; г – р. Bacterium Fig. 2. Microscopy of bacteria isolated from the red tilapia gills (meat-peptone agar medium): а – g. Bacterium; б – g. Actinomycetales; в – g. Bacillus; г – g. Bacterium Установлено, что в качественном составе микробиоценоза жабр двухгодовиков красной тиляпии как в контрольном, так и в опытных вариантах преобладали представители р. Bacterium, в меньшем количестве представлены бактерии р. Actinomycetales и р. Bacillus (1-2 колонии). При изучении культуральных свойств выделенных микроорганизмов на среде Сабуро в жабрах рыб были обнаружены следующие бактериальные колонии: округлые, мелкого и среднего размера, светло-розового цвета, с ровными краями, выпуклые, гладкие; округлые, маленького размера, светло-коричневого цвета, с неровными краями, выпуклые, гладкие; округлые, маленького размера, кремового цвета, с ровными краями, выпуклые, гладкие; округлые, средние по размеру, молочного цвета, с ровными краями, плоские, гладкие (табл. 2). Таблица 2 Table 2 Культурально-морфологическая характеристика кМАФАнМ жабр красной тиляпии на среде Сабуро Cultural and morphological characteristics of QMAFAnM of red tilapia gills in Sabouraud's medium Группа Число колоний Культуральные свойства колоний Морфологические свойства клеток Предположительно род Опытная 1 57 Округлые, мелкого и среднего размера, светло-розового цвета, с ровными краями, выпуклые, гладкие колонии Г+, бациллококковая смешанная флора Staphylococcus Bacterium Опытная 2 1 Округлая, маленького размера, светло-коричневого цвета, с неровными краями, выпуклая, гладкие колонии Г+, неспорообразующие палочки Bacterium 1 Округлая, маленького размера, кремового цвета, с ровными краями, выпуклая, гладкие колонии Г+, неспорообразующие палочки Bacterium Контрольная 3 Округлые, средние по размеру, молочного цвета, с ровными краями, плоские, гладкие колонии Г+, неспорообразующие палочки Bacterium Обнаружено, что в качественном составе микрофлоры жабр всех вариантов выращивания доминировали представители р. Bacterium и р. Staphylococcus, в наибольшем количестве данные микроорганизмы представлены в первой опытной группе, где рыба выращивалась с добавлением бактериофага в воду аквариума (рис. 3). а б в Рис. 3. Микроскопия бактерий, выделенных из жабр красной тиляпии (среда Сабуро): а – р. Staphylococcus, р. Bacterium; б – р. Bacterium; в – р. Bacterium Fig. 3. Microscopy of bacteria isolated from the red tilapia gills (Sabouraud's medium): а – g. Staphylococcus, g. Bacterium; б – g. Bacterium; в – g. Bacterium На следующем этапе экспериментальных работ проведен анализ микробиоценоза кишечника двухгодовиков красной тиляпии. Изучение культурально-морфологических свойств выделенных изолятов бактерий на среде МПА показало, что микрофлора кишечника красной тиляпии в основном была представлена грамположительными неспорообразующими палочками и кокками, составляющими 75 % всех выделенных микроорганизмов (табл. 3). Таблица 3 Table 3 Культурально-морфологическая характеристика кМАФАнМ кишечника красной тиляпии на среде МПА Cultural and morphological characteristics of QMAFAnM of red tilapia intestine in meat-peptone agar medium Группа Число колоний Культуральные свойства колоний Морфологические свойства клеток Предположительно род Опытная 1 62 Округлые, мелкие по размеру, молочного цвета, с ровными краями, плоские, гладкие колонии Г+, неспорообразующие палочки Bacterium 2 Округлые, средние по размеру, молочно-коричневого цвета, с неровными краями, плоские, гладкие колонии Г+, неспорообразующие палочки Bacterium 2 Округлые, мелкие по размеру, молочного цвета, с ровными краями, плоские, гладкие колонии Г+, кокки Sarcina Опытная 2 8 Округлые, средние по размеру, молочно-коричневого цвета, с ровными краями, плоские, гладкие колонии Г+, кокки Staphylococcus Контрольная 1 Округлая, средняя по размеру, белого цвета, с ровными краями, плоская, гладкая колония Г+, образование ветвящегося мицелия Actinomycetales 24 Округлые, мелкие по размеру, молочного цвета, с ровными краями, плоские, гладкие колонии Г+, кокки Staphylococcus Качественный состав микробиоценоза в контрольном варианте был представлен 24 колониями кокковых форм р. Staphylococcus, а также ветвящимся мицелием р. Actinomycetales. Первая опытная группа характеризовалась доминированием представителей р. Bacterium (64 колонии), в единичном количестве присутствовали изоляты бактерий р. Sarcina. В кишечнике рыб второй опытной группы были обнаружены изоляты бактерий р. Staphylococcus. На рис. 4 представлены микро-фотографии выделенных микроорганизмов. а б в г д е Рис. 4. Микроскопия бактерий, выделенных из кишечника красной тиляпии (среда МПА): а – р. Bacterium; б – р. Bacterium; в – р. Sarcina; г – р. Staphylococcus; д – р. Actinomycetales; е – р. Staphylococcus Fig. 4. Microscopy of bacteria isolated from the red tilapia intestine (meat-peptone agar medium): а – g. Bacterium; б – g. Bacterium; в – g. Sarcina; г – g. Staphylococcus; д – g. Actinomycetales; е – g. Staphylococcus При анализе микробиоценоза кишечника красной тиляпии выявлены микроорганизмы, высеянные на среде Сабуро, с следующими культуральными свойствами: колонии округлые, маленького размера, молочно-коричневого цвета, с ровными краями, выпуклые, гладкие; колонии округлые, мелкого и среднего размера, светло-розового цвета, с ровными краями, выпуклые, гладкие; колонии округлые, мелкого и среднего размера, желто-оранжевого цвета, с ровными краями, выпуклые, гладкие; колонии округлые, мелкие по размеру, молочного цвета, с ровными краями, плоские, гладкие (табл. 4). Таблица 4 Table 4 Культурально-морфологическая характеристика кМАФАнМ кишечника красной тиляпии на среде Сабуро Cultural and morphological characteristics of QMAFAnM of red tilapia intestine in Sabouraud's medium Группа Число колоний Культуральные свойства колоний Морфологические свойства клеток Предположительно род Опытная 1 35 Округлые, маленького размера, молочно-коричневого цвета, с ровными краями, выпуклые, гладкие колонии Г+, кокки Micrococcus Опытная 2 2 Округлые, мелкого и среднего размера, светло-розового цвета, с ровными краями, выпуклые, гладкие колонии Г+, неспорообразующие палочки Bacterium 6 Округлые, мелкого и среднего размера, желто-оранжевого цвета, с ровными краями, выпуклые, гладкие колонии Г+, образование ветвящегося мицелия Actinomycetales Контрольная 56 Округлые, мелкие по размеру, молочного цвета, с ровными краями, плоские, гладкие колонии Г+, кокки Micrococcus 1 Округлая, большая, молочного цвета, с ровными краями, выпуклая, гладкая колония Г+, неспорообразующие палочки Bacillus Среди обнаруженных колоний были выявлены грамположительные неспорообразующие палочки и кокки, а также 6 мицеллярных колоний. Микробиоценоз кишечника красной тиляпии первой опытной группы характеризовался присутствием бактерий р. Micrococcus, второй опытной группы – присутствием изолятов бактерий р. Bacterium и р. Actinomycetales, в кишечнике рыб контрольного варианта были обнаружены 56 колоний бактерий р. Micrococcus и единственная колония неспорообразующих бактерий р. Bacillus (рис. 5). а б в г д Рис. 5. Микроскопия бактерий, выделенных из кишечника красной тиляпии (среда Сабуро): а – р. Micrococcus; б – р. Bacterium; в – р. Actinomycetales; г – р. Micrococcus; д – р. Bacillus Fig. 5. Microscopy of bacteria isolated from the red tilapia intestine (Sabouraud's medium): а – g. Micrococcus; б – g. Bacterium; в – g. Actinomycetales; г – g. Micrococcus; д – g. Bacillus Наличие бактерий р. Bacillus в кишечнике рыб способствует выделению биологически активных веществ, продуцированию различных пищеварительных ферментов, в результате чего улучшается пищеварение, повышается усвоение кормов и наблюдается увеличение среднесуточных приростов. Доминирующее положение во второй опытной группе и контроле изолятов бактерий р. Bacterium свидетельствует о значительном ограничении функционального значения микрофлоры кишечника и ослаблении ферментативных свойств. Преобладание в кишечной микрофлоре бактерий с ослабленными ферментативными свойствами может свидетельствовать о начале дисбактериоза. Заключение По результатам проведенных исследований установлено, что большинство изолятов бактерий выделено из проб кишечника, это обусловлено обилием в нем питательных веществ и интенсивным протеканием процессов их преобразования за счет деятельности микроорганизмов. Доминирующее положение в микробиоценозе кишечника красной тиляпии занимали представители р. Micrococcus, доля которых составила 45,7 % от всех изолятов желудочно-кишечного тракта. На втором месте по частоте встречаемости были представители р. Bacterium (33,2 %), на третьем месте – р. Staphylococcus (16,1 %). Остальные группы микроорганизмов кишечника представлены значительно меньшим числом изолятов. Жаберный аппарат двухгодовиков красной тиляпии в сравнении с кишечником характеризовался менее разнообразным видовым составом микробиоты. Доминирующее положение в микробиоценозе жабр красной тиляпии занимали грамположительные бактерии р. Bacterium (58,2 %) и р. Staphylococcus (37,3 %), также были выделены единичные колонии изолятов бактерий р. Bacillus.
1. Kowalska J. D., Kazimierczak J., Sowinska P. M., Wojcik E. A., Siwicki A. K., Dastych J. Growing Trend of Fighting Infections in Aquaculture Environment - Opportunities and Challenges of Phage Therapy // Antibiotics. 2020. V. 9. 301 p.
2. Sharma S., Chatterjee S., Datta S., Prasad R., Dubey D., Prasad R. K. R., Vairale M. G. Bacteriophages and its applications: An overview // Folia Microbiol. 2016. V. 62. P. 17-55.
3. Litvina L. A. Mikrobiocenoz kishechnika i ego rol' v podderzhanii gomeostaza // Problemy sel'skohozyaystvennoy ekologii. Novosibirsk, 2000. S. 51-52.
4. Sorokin V. V., Timoshko M. A., Nikolaeva A. V. Normal'naya mikroflora kishechnika zhivotnyh. Kishinev: Shtiinca, 1973. S. 3-68.
5. Shivokene Ya. Simbiontnoe pischevarenie u gidrobiontov i nasekomyh. Vil'nyus: Mokslas, 1989. 223 s.
6. Ponomarev S. V., Grozesku Yu. N., Bahareva A. A. Industrial'noe rybovodstvo: ucheb. SPb.: Lan', 2013. 420 s.
7. Hoult Dzh., Kriga N., Snit P., Steyli Dzh., Uil'yams S. Opredelitel' bakteriy Berdzhi: v 2 t. M.: Mir, 1997. 1250 s.
