SPECIFIC FEATURES OF EMBRYONIC DEVELOPMENT OF POND SNAIL (LYMNAEA STAGNALIS L.) UNDER ANTHROPOGENIC INFLUENCE OF CHLORIDE COMPOUNDS IN WATER
Authors:
1.
Russian Federation
2.
K. G. Razumovsky Moscow State University of Technologies and Management (the First Cossack University)
(Candidate of Biology; Leading Researcher of the Center “Aquaculture”;)
employee
Russian Federation
employee
Russian Federation
3.
K. G. Razumovsky Moscow State University of Technologies and Management (the First Cossack University)
(Senior Lecturer of the Department of Ecology and Nature Management, senior lecturer)
employee
Russian Federation
employee
Russian Federation
Type:
Article
Pages:
from 134
to 141
Status:
Published
Received:
24.09.2021
Accepted:
26.09.2021
Published:
26.09.2021
Subject area:
UDK 57 Биологические науки
Language:
Russian
Keywords:
toxicity, pond snail, mollusk, chlorobenzene, tetrachloroethylene, concentration
Abstract (English):
The article highlights the research of embryonic development of hydrobionts under the influence of anthropogenic factors of water solutions – chlorobenzene and tetrachloroethylene. To detect the toxicity of chloride pollutants in a freshwater reservoir, representatives of benthic mollusks (big pond snail Lymnaea stagnalis L.) were used as a model organism. According to the results of research, it was found that at a concentration of 0.01 mg/l of chlorobenzene solution individual anomalies of embryonic development of the pond fish are observed, but at higher concentrations its development is delayed by 5-6 stages in comparison with the control. As an integral parameter of pond fish development, we can take indicators of the biological toxicity criterion: Hatchling and its survival over a 10-day period after leaving the egg shells. Changes in the physiological parameters of pond fish embryos begin with a chlorobenzene concentration of 0.01 mg/l; the maximum permissible concentration for tetrachloroethylene for the considered biological indicators should be considered 0.05 mg/l. It is noted that in big pond snail (Lymnaea stagnalis L.) the hatch of juveniles from egg shells is the most sensitive indicator when determining the toxicity of an aqueous solution; and less sensitive indicators are the number of eggs laid and the survival of juveniles in the first 10 days after hatching. The test object used is a large pond, which has shown a high sensitivity to contamination of the water environment with chlorinated ecotoxicants and can be recommended for a comprehensive quality assessment when biotesting freshwater waters
The article highlights the research of embryonic development of hydrobionts under the influence of anthropogenic factors of water solutions – chlorobenzene and tetrachloroethylene. To detect the toxicity of chloride pollutants in a freshwater reservoir, representatives of benthic mollusks (big pond snail Lymnaea stagnalis L.) were used as a model organism. According to the results of research, it was found that at a concentration of 0.01 mg/l of chlorobenzene solution individual anomalies of embryonic development of the pond fish are observed, but at higher concentrations its development is delayed by 5-6 stages in comparison with the control. As an integral parameter of pond fish development, we can take indicators of the biological toxicity criterion: Hatchling and its survival over a 10-day period after leaving the egg shells. Changes in the physiological parameters of pond fish embryos begin with a chlorobenzene concentration of 0.01 mg/l; the maximum permissible concentration for tetrachloroethylene for the considered biological indicators should be considered 0.05 mg/l. It is noted that in big pond snail (Lymnaea stagnalis L.) the hatch of juveniles from egg shells is the most sensitive indicator when determining the toxicity of an aqueous solution; and less sensitive indicators are the number of eggs laid and the survival of juveniles in the first 10 days after hatching. The test object used is a large pond, which has shown a high sensitivity to contamination of the water environment with chlorinated ecotoxicants and can be recommended for a comprehensive quality assessment when biotesting freshwater waters
Keywords:
toxicity, pond snail, mollusk, chlorobenzene, tetrachloroethylene, concentration
toxicity, pond snail, mollusk, chlorobenzene, tetrachloroethylene, concentration
Введение
К гидробионтам относится большая группа организмов водоема, включая водных беспозвоночных и позвоночных животных. Высокая чувствительность водных организмов к вредным веществам на стадиях эмбрионального развития была обнаружена при исследовании токсичности ряда органических и неорганических соединений. Например, выклев прудовика в 2 раза чувствительнее, чем у дафний, к трибутилоловохлориду, а выживаемость эмбрионов вьюна была в 100 раз ниже по сравнению с выживаемостью дафний [1].
Многими исследователями отмечена высокая чувствительность отдельных стадий развития водных организмов к действию экотоксикантов – загрязнителей окружающей среды. Так, по мнению Н. С. Строганова, достаточно достоверным критерием при остром отравлении является выживаемость [1]. Например, при действии малых доз некоторых токсикантов на организм он живет достаточно долгое время, и создается впечатление о его благополучии, но развивающееся нарушение размножения или развития в результате приводит к появлению неполноценного потомства. Исходя из этого Н. С. Строганов ввел понятие биологического критерия токсичности, за основу которого принято наблюдение за развитием и размножением гидробионтов, – параметрами, которые в настоящее время достаточно затруднительно прогнозировать с помощью существующих средств [2].
На сегодняшний день специалисты уже активно используют показатели нарушения эмбрионального развития в методиках по установлению рыбохозяйственных ПДК. Из области гигиенического нормирования выделилась в самостоятельное направление экспериментальная тератология, которая позволяет устанавливать отдаленный биологический эффект действия токсических веществ, попадающих в окружающую среду в малых концентрациях [3, 4].
Наиболее часто в водоемах рыбохозяйственного значения сегодня можно встретить загрязнители 3-го и 4-го классов опасности [5], по этой причине для изучения антропогенного воздействия веществ с различной токсичностью и мутагенностью в нашем исследовании использовались растворы хлористых веществ: хлорбензол и тетрахлорэтилен [6].
Проведенные ранее исследования позволили определить критерии токсичности различных загрязнителей в водной среде на эмбриональных стадиях развития гидробионтов, что сделало их излюбленным объектом водных токсикологов [4, 6, 7]. Тест-организм для наших исследований подбирался исходя из фактических возможностей определения показателей «биологического критерия токсичности» на различные периоды его онтогенеза.
Целью настоящего исследования было выявление особенностей эмбрионального развития прудовика Lymnaea stagnalis L. при воздействии некоторых хлористых соединений в воде в качестве экотоксикантов [8].
Материал и методы исследований
Для сравнительной оценки токсичного воздействия растворов хлорбензола и тетрах-лорэтилена на критические периоды развития в опыт в качестве тест-объекта был взят представитель бентосных моллюсков – прудовик большой Lymnaea stagnalis L., который может быть отнесен к нейстонным организмам. Эмбриональное развитие прудовика и его стадии описаны сегодня достаточно подробно [7], а при наблюдении за его развитием в эмбриогенезе требуется только микроскоп типа МБС-10, другого специального оборудования не требуется.
Моллюсков отбирали из малых водоемов Московской области. Для определения наличия у них возможных промежуточных паразитов – диплостом – отобранные тест-объекты помещали на 3 дня по одной штуке в лабораторные сосуды емкостью 150 мл.
Адаптация прудовиков к лабораторно-экспериментальным условиям была организована
в специальных стеклянных аквариумах объемом по 10 л каждый в течение 3-х недель (кон-троль), после чего прудовики помещались по 10 шт. в 5-литровые аквариумы (допустимая норма воды на одного прудовика – 0,5 л) при температуре воды 20–23 °С [9]. Раковина моллюсков, принятых в опыт, составляла в высоту 38–42 мм.
Опыт длился 15 дней, продолжительность хронического опыта – 45 дней. Опыты ставились в трехкратной повторности. Кормили прудовиков листьями одуванчика.
Отобранные кладки прудовиков помещали в чашки Петри с отстоянной водой и растворами различных исследуемых токсикантов в разной концентрации. Изучение кладок и эмбрионального развития проводили под лабораторным микроскопом.
В лабораторно-экспериментальных опытах с большим прудовиком были применены концентрации растворов хлорбензола 0,02; 0,01; 0,001; 0,0001 мг/л; концентрацию 0,1 мг/л решено было исключить из опытов, поскольку моллюски в этой концентрации гибли. Также было установлено, что при 48-часовой экспозиции прудовика в растворе тетрахлорэтилена концентрацией 30 мг/л выживает около 50 % тест-объектов, а потому определение летальной концентрации тетрахлорэтилена (LC50) в хронических опытах производилось в растворах с концентрациями 0,5; 0,1; 0,05; 0,005 мг/л.
Характеристика исследуемых в опытах веществ приведена ниже [10].
Хлорбензол. Производное бензола; представляет собой прозрачную жидкость, растворимость в воде примерно 49 мг/100 мл при 20 °C. Относится к 3 классу опасности. Применяется
в лакокрасочной промышленности и для получения взрывчатых веществ, как исходное сырье для синтеза пикриновой кислоты и динитрофенола. Оказывает выраженное токсическое воздействие на биосистемы организма позвоночных животных, главным образом на кровеносную
и нервную; под воздействием этих веществ кровь может подвергаться гемолизу; обладает кумулятивным эффектом и провоцирует лейкемию. По лимитирующему показателю токсичности санитарный норматив для хлорбензола в воде (ПДКв) – 0,02 мг/л, при этом низшие позвоночные менее устойчивы к хлорпроизводным соединениям [11].
Тетрахлорэтилен. Бесцветная жидкость с резким эфирным запахом, хлорорганический растворитель. Химическая формула: C2Cl4. Растворимость в воде примерно 0,015 г/100 мл при 20 °С. Относится к 3 классу опасности для водной среды. Применяется как растворитель и экстрагирующий агент в текстильной промышленности, в том числе для каучуков, пластмасс, жиров, для обезжиривания металлов, для производства хладона 113. Вещество представляет опасность для окружающей среды, особенно в воздухе в замкнутом объеме и воде (при контакте
с влагой вещество медленно разлагается с образованием трихлоруксусной и соляной кислот). Вещество способно всасываться в организм через кожу и при дыхании через рот, оказывая токсическое действие на ЦНС, печень, почки; вызывать раздражение глаз, кожи и дыхательных путей уже при кратковременном воздействии [10, 11].
Результаты исследований
Воздействие хлорбензола. Эмбриональное развитие и выклев молоди в присутствии хлорбензола исследовались на развивающейся икре моллюсков в чашках Петри в растворах
с концентрациями 0,02; 0,01; 0,001 и 0,0001 мг/л. Количество отложенных экспериментальными тест-организмами яиц оказалось выше на 18 % по сравнению с контролем; незначительный спад размножения наблюдался к концу опыта.
В ходе проведенных экспериментов установлено, что при воздействии хлорбензола в концентрации 0,01 мг/л имели место отдельные аномалии развития прудовиков: дробление бластомеров задерживалось; париетальные ганглии отставали в развитии от педальных ганглиев,
а презумптивные участки нервной системы дифференцировались с задержкой.
При характеристике органогенеза в целом, по сравнению с контролем, при высоких концентрациях хлорбензола происходила задержка развития эмбриональных стадий прудовиков примерно на 5-6 стадий, при этом влияния на эмбриогенез концентрации хлорбензола 0,001 мг/л и ниже не отмечено.
Показатели выклева и выживаемости в течение 10 дней после выхода из яйцевых оболочек – как интегральный биологический параметр эмбрионального развития тест-объекта – представлены ниже (табл. 1).
Таблица 1
Интегральные показатели биологического критерия токсичности
в растворах хлорбензола у молоди прудовика
Концентрация
хлорбензола, мг/л Выклев, дни опыта Средний выклев за 45 дней Выживаемость, %
1–15 16–30 31–45
0,0001 79 91 94 89 98
0,001 79 85 84 81 100
0,01 68 72 77 71* 89
0,02 75 71 74 73* 67*
Контроль 76 80 83 79 100
* Достоверная разница средних (Р ≥ 0,95; tSt = 2,75; td = 2,85).
Инкубационный период зародышей прудовика зависел от концентрации хлорбензола:
в контроле развитие занимало от 16 до 22 дней, а при концентрации хлорбензола 0,01 мг/л этот интервал увеличивался в 2 раза.
В качестве дополнительного информативного качественного показателя физиологического состояния эмбрионов прудовика в различных концентрациях хлорбензола контролировалась частота ударов сердца у зародышей на 28 стадии развития; в контроле средняя частота ударов сердца у зародышей составила 41; при воздействии хлорбензола в концентрации 0,0001 мг/л – 40; в концентрации 0,001 мг/л – 37; 0,01 мг/л – 34; 0,02 мг/л – 31, что указывает на измененяемые физиологические показатели у эмбрионов прудовика. Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что выклев моллюсков из яйцевых оболочек за первые 10 дней более чувствительный показатель, чем выживаемость молоди.
Воздействие тетрахлорэтилена. Развитие прудовиков в эмбриогенезе изучалось в концентрациях раствора, которые применялись при определении воздействия токсиканта на выживаемость и число отложенных яиц (0,5; 0,1; 0,05; 0,005 мг/л) при этом концентрация 0,1 мг/л вызывала как рассинхронизацию дробления бластомеров, так и отклонения при образовании велигера и великонха в гаструляции.
Исследования выклева и последующего развития молоди прудовика в течение 10 дней
в растворах тетрахлорэтилена показали, что определенная общая закономерность сохраняется,
а именно: выклев более чувствителен к токсическому воздействию, чем выживаемость. Результаты опыта представлены ниже (табл. 2).
Таблица 2
Интегральные показатели биологического критерия токсичности
в растворах тетрахлорэтилена у молоди прудовика
Концентрация
тетрахлорэтилена, мг/л Выклев (дни опыта) Средний выклев за 45 дней Выживаемость, %
1–15 16–30 31–45
0,005 74 80 76 78 100
0,05 77 82 74 76 98
0,1 55 54 47 53* 93
0,5 31 23 17 25* 65*
Контроль 75 82 85 79 100
* Достоверная разница средних (Р ≥ 0,95; tSt = 2,75; td = 2,95).
Максимально допустимой концентрацией тетрахлорэтилена по рассматриваемым биологическим показателям следует считать 0,05 мг/л.
Обсуждение результатов
При внимательном рассмотрении индивидуального развития гидробионтов становится очевидно, что поведение индивидуума и положение клеток в развивающемся организме зависит от межклеточного взаимодействия [12]. На важность такого взаимодействия развивающихся систем организма указывает и множество появившихся в печати за последнее время работ, позиционирующих организм как единое целое. Так, Б. Гудвин сформулировал важный вывод, что в организации индивидуального развития живого организма наиболее значимую роль играет так называемое «согласованное взаимодействие» отдельных систем организма [13]. Выявление механизмов контроля пропорционального соотношения различных частей организма при его развитии представляет собой малоисследованную область.
Объектом проверки всей сложной цепи сопряженных реакций этих систем организма, направленных на реализацию генетической информации, может служить как сам организм, так и популяция (при исследовании биоценоза как целого). Таким образом, при воздействии вредных веществ (экотоксикантов) на гидробионтов за критерии токсичности следует брать не только размножение, но и степень реализации генетической программы, или ранний онтогенез [14].
По мнению Н. С. Строганова, в онтогенезе многих организмов необходимо отмечать как минимум 3 наиболее важных периода: до начала созревания, период размножения и старость.
У каждого из этих периодов свои особенности и критерии токсичности [2] и различные популяционные особенности, например, одни организмы размножаются только половым путем, другие – половым и бесполым, у третьих образуются споры, латентные яйца и пр. в зависимости от жизненных условий [2]. Что следует считать периодами размножения или периодами старости в этих случаях – не вполне ясно.
Наиболее важными для водных токсикологов представляются исследования в периоды эмбрионального развития водных организмов, особенно на стадиях с морфогенетическими сдвигами и изменением регуляции формообразования [12]. Для рыб, например, стадиями развития с повышенной чувствительностью к токсикантам являются гаструляция, выклев, начало работы сердца [15]. У гидробионтов встречаются практически все типы размножения и развития, известные в современной эмбриологии, и исследования в этой связи можно свести от реализации генетической пространственной информации в целом, к морфогенезу.
Особенно важными для водной токсикологии можно назвать эмбриональные стадии развития гидробионтов, когда у организмов происходят значительные морфогенетические сдвиги, что обусловлено взаимодействием межклеточных систем [12]. Например, выклев молоди моллюсков и их эмбриональное развитие представляются более чувствительными показателями по сравнению с выживаемостью [16].
Тест-организмы в виде простейших и показатели их развития редко использовались ранее водными токсикологами в связи с недостаточностью достоверных методик культивирования многих видов [6]. Однако появление стандартов на токсикологические тесты, в первую очередь по морфологическим показателям, продемонстрировало высокую чувствительность простейших и их быстрое реагирование на изменение окружающей водной среды в присутствии ряда загрязнителей [14]. Размножение и взаимодействие клеток в токсикологических тестах на качество воды, например у Paramecium caudatum, Amoeba proteus, Euglena gracilis, имеют сегодня первостепенное значение [17, 18].
Взаимодействие клеток простейших организмов не является единственным информативным показателем при разработке методов определения экотоксичности химических соединений в водной среде, а сложные сопряженные взаимосвязи между организмами, например крабами, отмечены рядом экологов [19]. Сопряженные реакции, сопровождающие морфологические изменения индивидуальных жизненно важных параметров гидробионтов, также позволяют судить о степени токсичности исследуемого вещества [20].
Заключение
У брюхоногих моллюсков Lymnaea stagnalis выклев молоди из яйцевых оболочек является наиболее чувствительным показателем при определении токсичности вещества; менее чувствительными показателями являются количество отложенных яиц и выживаемость молоди в первые 10 дней после выклева.
Изменение физиологических показателей эмбрионов прудовика в присутствии загрязнителей начинается с концентрации хлорбензола 0,01 мг/л, когда наблюдались отдельные аномалии эмбрионального развития прудовика; при более высоких концентрациях его развитие задерживалось на 5-6 стадий по сравнению с контролем.
Максимально допустимой концентрацией тетрахлорэтилена по рассматриваемым биологическим показателям следует считать 0,05 мг/л.
Используемый тест-объект прудовик большой продемонстрировал высокую чувствительность к загрязнению водной среды хлористыми экотоксикантами и может быть рекомендован для комплексной оценки качества пресных вод методами биотестирования.
1. Stroganov N. S., Putincev A. I., Isakova E. F., Shigin V. I. Metod toksikologicheskogo kontrolya stochnyh vod // Biologicheskie nauki. 1979. № 2. S. 90-96.
2. Stroganov N. S. Nauchnye osnovy ustanovleniya PDK toksicheskih veschestv v otkrytyh vodoemah (biologicheskie osobennosti) // Vodnye resursy. M., 1974. S. 110-121.
3. Wilson J. G. Environmental chemicals. Handbook of teratology. N. Y., London: Plenum press, 1977. V. 1. P. 47-75.
4. Ob utverzhdenii Metodicheskih ukazaniy po razrabotke normativov kachestva vody vodnyh ob'-ektov rybohozyaystvennogo znacheniya, v tom chisle normativov PDK vrednyh veschestv v vodah vodnyh ob'ektov rybohozyaystvennogo znacheniya: prikaz Federal'nogo agentstva po rybolovstvu ot 04 avgusta 2009 g. № 695 (v red. ot 22 dekabrya 2016 g.). URL: https://docs.cntd.ru/document/902172637 (data obrasche-niya: 04.09.2020).
5. Artyuhova V. I., Dmitrieva A. G., Isakova E. F., Larin V. E., Putincev A. I., Filenko O. F. Mo-nitoring vod rek Podmoskov'ya metodami biotestirovaniya // Vodnye resursy. 1991. № 1. S. 115-121.
6. Sotnikov F. I. Kriticheskie periody v rannem ontogeneze gidrobiontov i ih rol' v biotestiro-vanii i ekologo-rybohozyaystvennom normirovanii: dis. … kand. biol. nauk. M., 2005. 148 s.
7. Mescheryakov V. N. Prudovik Lymnaea stagnalis // Ob'ekty biologii razvitiya. M.: Nauka, 1975. C. 53-92.
8. RD 52.24.669-2005. Unificirovannye metody biotestirovaniya dlya obnaruzheniya toksicheskogo za-gryazneniya poverhnostnyh vod sushi s ispol'zovaniem mikrozooplanktona. M.: GU CKB GMP, 2005. 28 s.
9. Danil'chenko O. P. Sravnitel'naya reakciya embrionov i predlichinok ryb na nekotorye prirodnye i sinteticheskie soedineniya // Vopr. ihtiologii. 1982. T. 22, vyp. 1. S. 128-138.
10. Bol'shaya enciklopediya nefti i gaza. URL: https://ngpedia.ru/index.html (data obrascheniya: 20.08.2020).
11. Kancerogennye veschestva: sprav. M.: Medicina, 1987. 332 s.
12. Nikiforov-Nikishin A. L. Morfologicheskie osobennosti hrustalika gidrobiontov i ih prime-nenie v vodnoy toksikologii: avtoref. dis. … d-ra biol. nauk. M., 2005. 49 s.
13. Gudvin B. Analiticheskaya fiziologiya kletok i razvivayuschihsya organizmov. M.: Mir, 1979. 285 s.
14. Gorbunov A. V., Nikiforov-Nikishin D. L., Gorbunov O. V. Izmenenie ontogeneticheskih pokaza-teley u Daphnia magna pod vozdeystviem rastvorov nekotoryh benzol'nyh soedineniy // Vestn. Astra-han. gos. tehn. un-ta. Ser.: Rybnoe hozyaystvo. 2021. № 2. S. 125-133.
15. Zhukinskiy V. V. Vliyanie abioticheskih faktorov na raznokachestvennost' i zhiznesposobnost' ryb v rannem ontogeneze. M.: Agropromizdat, 1986. 244 s.
16. Stroganov N. S., Kolosova L. V. Osobennosti razmnozheniya gidrobiontov v hronicheskom opyte pri vozdeystvii metalloorganicheskih soedineniy // Biofizicheskie aspekty zagryazneniya biosfery. M.: Nauka, 1973. S. 140-141.
17. Mills W. L. Water quality bioassay using selected protozoa // Environ. Sci. and Health. 1976. V. A 11. N. 7. P. 491-500.
18. Gorbunov A. V., Gorbunov O. V., Kochetkov N. I., Nikiforov-Nikishin D. L. Ocenka sostoyaniya ma-lyh vodoemov Sergievo-Posadskogo rayona po taksonomicheskomu raznoobraziyu zelenyh, sine-zelenyh, diatomovyh i dinofitovyh vodorosley // Rybovodstvo i rybnoe hozyaystvo. 2021. № 1 (180). S. 18-31.
19. Ochme M., Bartonova A., Knutzen S. Estimation of polychlormated dibenzofuran and dibenzo-p-dioxin contamination of a coastal region using isomer profiles in crabs // Environ. Sci. and Technol. 1990. V. 24. N. 12. P. 1836-1841.
20. Dre F. Ekologiya. M.: Atomizdat, 1976. 125 s.
