HEMATOLOGICAL AND BIOCHEMICAL INDICATORS OF AUSTRALIAN RED-CLAW CRAYFISH HEMOLYMPH
Abstract and keywords
Abstract (English):
The article describes Australian red claw crayfish, Cherax quadricarinatus, which is currently one of the most promising cultivation targets. However, to increase production volumes, it is necessary to improve cultivation technologies, which should be based on the data of physiological and biochemical parameters. An objective method for monitoring the physiological state of Australian red claw crayfish in the artificial conditions is determining its hematological and biochemical indicators that complement the general characteristics of hemolymph and later define its physiological norm. When giving the objects the compound feed, which the authors produced by their own recipe, there was recorded a high level of total hemolymph protein of 40.8 ± 4.5 g/l. According to the results of biochemical research, the cholesterol content in the hemolymph of Australian crayfish was 3.2 ± 0.6 mmol/l, and the concentration of lipoproteins was 0.8 ± 0.2 g/l (levels within the reference values). When considering the hemogram of hemolymph there were found the dominant types and linear dimensions of native formed elements. The diameter of agranulocytes in Australian freshwater crayfish varied from 85 to 90 μm, semi-granulocytes - from 90 to 95 μm, granulocytes - from 65 to 78 μm, transparent cells differed by greater variability in size, which ranged from 85 to 120 μm. The part of granulocytes in relation to other shaped elements exceeded 50%, for transparent cells it turned out to be above 20%, for semi-granulocytes - about 15% and for agranulocytes - about 5%, which means that the latter form the rarest group. The established ratios are specific for Cherax quadricarinatus, its hemocytic characteristics greatly differs from Astacus leptodactylus, which is the main object of comparative research. The results of comparative analysis of the cellular composition of the hemolymph of the Australian freshwater crayfish Cherax quadricarinatus (Von Martens, 1868) demonstrate the taxonomic specificity of this representative of freshwater aquaculture

Keywords:
hemolymph, hemocyte formula, physiological and biochemical parameters, compound feed, Australian red claw crayfish
Text
Publication text (PDF): Read Download

Введение Красноклешневый австралийский рак Cherax quadricarinatus (Von Martens, 1868) является популярным объектом пресноводной аквакультуры [1]. Пресноводный десятиногий ракообразный стал важным объектом аквакультуры в нескольких странах мира из-за питательной ценности и экономической целесообразности выращивания. Объемы производства австралийского рака в Австралии – около 400 т/год, в Мексике – 50 т/год, в Белизе, Панаме и США – около 10 т/год. Широкое производство развернуто в Эквадоре, Марокко и в Испании, но точные объемы производств неизвестны [2]. Технологии выращивания данного объекта зависят от основных фондов рыбоводных предприятий, квалификации специалистов с необходимыми знаниями и опытом в области сельского и рыбного хозяйства, работающих в области культивирования нерыбных объектов [3]. Производство австралийских красноклешневых раков во многих странах рассчитано, прежде всего, на распространение продукции внутри страны, но уже в течение ряда лет наблюдается экспортный спрос на этот объект. Но в технологии выращивания красноклешневых раков имеется ряд моментов, требующих уточнений, а именно предложений по составу рецептуры комбикормов (стартовых, продукционных), оказывающему значительное влияние на улучшение физиологических и биохимических показателей и увеличение потенциала хозяйственных свойств объекта. Данная работа направлена на определение физиологических и биохимических показателей австралийских красноклешневых раков, выращиваемых в искусственных условиях при кормлении комбикормом по рецептуре, разработанной авторами исследования. Согласно исследованиям [4–10], объективным методом контроля физиологического состояния является определение общего белка гемолимфы как биоиндикатора условий выращивания и подсчет клеток гемолимфы (общий и дифференциальный). Цель исследования – дополнить общую характеристику физиологического состояния австралийских красноклешневых раков гематологическими и биохимическими показателями, а также гемоцитарной формулой (гемограмма) [11, 12]. Материалы и методы исследования Экспериментальные работы проводили на базе Инновационного центра «Биоаквапарк – НТЦ аквакультуры» ФГБОУ ВО «Астраханский государственный технический университет». В качестве объектов исследования использовались особи австралийских красноклешневых раков Cherax quadricarinatus (Von Martens, 1868) рода Cherax. При выращивании ракообразные содержались в рыбоводных емкостях объемом 400 л, оснащенных укрытиями, при разреженной плотности посадки, с оборотной водоочисткой и подогревом воды. Контроль за гидрохимическими показателями водной среды проводили ежедневно в соответствии с общепринятыми гидрохимическими методами. Температура воды составила +27,0 °С, содержание кислорода – 7,4–8,2 мг/л, соблюдался режим освещения «день/ночь». Выращивание производили на рецептуре комбикорма, разработанной авторами [13–18], общий состав экспериментальной рецептуры представлен компонентами растительного происхождения (пшеничная мука, соевая мука, мука из тыквы, морковь, укроп), животного происхождения (рыбная и мясокостная мука, гаммарусы и дафнии), минеральными веществами (мел и минеральный премикс), жировыми компонентами (подсолнечное масло и рыбий жир), дополнительным компонентом (закрепитель гранул). Физиологическое состояние выращиваемых объектов оценивалось по биохимическим показателям [19–22], отбор гемолимфы проводился in vivo по указаниям [23], из вентрального синуса прижизненно с сохранением здоровья, с соблюдением мер асептики и антисептики. Измерение оптической плотности экспериментальных проб проводили при помощи спектрофотометра Unico 2100. Изучение наиболее мелких деталей на гистологических препаратах гемолимфы производили с помощью электронного микроскопа Olympus (Япония). Гемоцитарную формулу процентного соотношения различных типов гемоцитов определяли по мазкам гемолимфы австралийских красноклешневых раков. Мазки гемолимфы готовили при помощи фиксатора-красителя фирмы «Ольвекс-диагностикум» (Россия), используя метод Май-Грюнвальда. Идентификацию гемоцитов проводили по стадиям их цитогенеза, оценивая дифференциальным подсчетом 4-х типов клеток. Для сравнительного анализа гемоцитарной формулы гемолимфы австралийских раков использовали данные по речным ракам из литературных источников [23, 24]. В ходе экспериментальной работы полученные данные статистически обработали методом вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excel 2016. При расчете применили t-критерий Стьюдента, достоверными считались различия показателей при р < 0,05. Результаты исследований Исследованиями установлено, что при выращивании австралийских раков сбалансированный комбикорм, отвечающий физиологическим потребностям объекта, удовлетворительно отражается на показателе темпа роста и уровне белка гемолимфы. Физиологические и биохими-ческие показатели гемолимфы раков, выращенных на экспериментальном комбикорме, пред-ставлены в табл. 1. Таблица 1 Биотехнологические показатели выращивания Cherax quadricarinatus Показатель Значение Условия содержания Объем емкости, м3 4 Уровень воды, см 70 рН 7,2 О2, мг/л 8,1 Кормление, раз/сут 2 Плавучесть используемого корма отрицательная (тонущие) Период выращивания, сут 120 Рыбоводно-биологические показатели Абсолютный прирост, г 75,6 Кормовой коэффициент 0,9 Физиолого-биохимические показатели Общий белок, г/л 40,8 + 4,5 Холестерин, ммоль/л 3,2 ± 0,6 Бета-липопротеиды, г/л 0,8 ± 0,2 Выживаемость, % 80 В результате анализа гемолимфы ракообразных установлено, что содержание общего белка составило 40,8 ± 4,5 г/л. Высокий уровень общего белка как биоиндикатора свидетельствует о качественных условиях выращивания, повышенном уровне обмена веществ, а также о достаточной подготовленности генеративного обмена у особей австралийских раков. Поступление источников липидов отражается на показателе холестерина в гемолимфе у ракообразных, что впоследствии влияет на статус липидного обмена организма. Холестерин участвует в образовании половых гормонов, подготавливает производителей к нересту, увеличивает плодовитость. Также холестерин улучшает стрессоустойчивость, формируя естественную реакцию организма на стресс, стимулирует выделение адренокортикотропина, который, в свою очередь, обеспечивает синтез и секрецию кортикоидных гормонов (кортизола, кортизона, кортикостерона) [25]. О неудовлетворительном состоянии организма свидетельствует показатель уровня холестерина в гемолимфе выше 3,5 г/л, указывая на воздействие стрессирующих факторов среды и патологию. В нашем эксперименте содержание холестерина в гемолимфе составило у австралийских раков 3,2 ± 0,6 ммоль/л, что находится в пределах референтных значений. Уровень концентрации беталипопротеидов менее 0,5 г/л и более 6 г/л свидетельствует о резорбировании половых продуктов. С патологичным уровнем бета-липопротеидов в гемолимфе производители имеют нежизнеспособную икру, т. к. в процессе ее формирования отмечаются изменения фракционного состава белков и соотношения липидов, которые переносятся в икру бета-липопротеидами. В нашем эксперименте этот показатель составил 0,8 ± 0,2 г/л, концентрация бета-липопротеидов находилась в пределах референтных значений. На втором этапе экспериментальной работы исследовали гемограмму, оценка гемоцитарной формулы проводилась по дифференциальному подсчету 4-х типов гемоцитов (ГЦ) (рис. 1). Рис. 1. Гемоциты Cherax quadricarinatus: 1 – агранулоцит; 2 – полугранулоцит; 3 – гранулоцит; 4 – прозрачная клетка Оптическое микроскопирование и дифференцировку проводили с учетом характеристики грануляции протоплазмы и размера клеток (рис. 2). а б в г Рис. 2. Нативные форменные элементы гемолимфы Cherax quadricarinatus: а – агранулоцит; б – полугранулоцит; в – гранулоцит; г – прозрачная клетка Агранулоциты (ГЦ I). У австралийского рака, судя по диаметру клеток, это не самые малые гемоциты (табл. 2), по величине занимают 3 место среди форменных элементов гемолимфы. Таблица 2 Линейные размеры гемоцитов Типы гемоцитов Диаметр, мкм (М ± m) Прозрачная клетка 103,64 ± 0,6 Полугранулоцит 93,87 ± 0,1 Агранулоцит 86,7 ± 0,1 Гранулоцит 67,08 ± 0,2 *Увеличение 60 × 0,90. У речных раков гемоциты этого типа имеют сферичную форму и малые размеры, содержат небольшое количество крошечных цитоплазматических включений. Гемоциты этого типа дольше других клеток сохраняются на стекле в неизменном виде [24]. Образцы исследовались при увеличении 60 × 0,90, диаметр агранулоцитов варьирует от 85 до 90 мкм (рис. 3). а б в г Рис. 3. Нативные форменные элементы гемолимфы (Cherax quadricarinatus) с обозначением диаметра форменных элементов (увеличение 60 × 0,90): а – агранулоцит; б – полугранулоцит; в – гранулоцит; г – прозрачная клетка Полугранулоциты (ГЦ II) у австралийских раков исследовались при увеличении микро-скопа 60 × 0,90, диаметр полугранулоцитов варьирует от 90 до 95 мкм, среднее значение составляет 93,87 ± 0,1. Гемоциты этого типа более крупные по сравнению с другими форменными элементами гемолимфы. Их цитоплазма заполнена меньшим количеством микроскопических лучепреломляющих гранул. Также наблюдаются клетки веретенообразной формы с расположенным по центру ядром. Цитоплазма ГЦ II клеток на стекле быстро разрушается, а через 35 мин они становятся трудно отличимыми от ГЦ I. Гранулоциты (ГЦ III). У австралийских пресноводных раков это самые малые гемоциты – диаметр гранулоцитов варьирует от 65 до 78 мкм. Среднее значение составляет 67,08 ± 0,2 мкм. Их цитоплазма заполнена многочисленными и крупными гранулами, лучепреломление высокое. По данным других авторов, у речных раков исследуемые клетки ГЦ III являются самыми крупными клетками гемолимфы и достигают больших размеров [24]. Прозрачные клетки (ГЦ IV). Диаметр прозрачных клеток у австралийских раков варьирует от 85 до 120 мкм. Среднее значение составляет 103,64 ± 0,6 мкм, таким образом, у австралийских раков это самые крупные клетки. При оптическом микроскопировании на стекле ядра клеток ГЦ IV не просматриваются из-за большого количества цитоплазмы. В табл. 3 представлена гемоцитарная формула австралийских красноклешневых раков. Таблица 3 Гемоцитарная формула Cherax quadricarinatus Показатель Значение, М± m Агранулоцит 5,0 ± 0,1 Полугранулоцит 15,0 ± 0,6 Гранулоцит 57,0 ± 1,2 Прозрачная клетка 23,0 ± 1,8 Процентное соотношение гранулоцитов, стабильно встречающихся в гемолимфе, а также прозрачных клеток составило 57,0 ± 1,2 и 23,0 ± 1,8 % соответственно. У австралийского рака нативные форменные элементы гемолимфы встречались редко – агранулоциты 5,0 ± 0,1 %, полугранулоциты 15,0 ± 0,6 %, что подтверждено статистически. Таким образом, в результате изучения гемограммы были выявлены наиболее стабильные формы: у австралийских раков – гранулоциты, процентное соотношение которых по отношению к другим форменным клеткам составило более 50 %, и прозрачные клетки, процентное соотношение которых по отношению к другим форменным клеткам составило более 20 %; промежуточную встречаемость занимают полугранулоциты – до 15 %; редко встречаемой группой оказались агранулоциты – около 5 %. В части видовой специфичности в процентном соотношении клеточных элементов гемолимфы были замечены различия, так, у австралийских раков агранулоциты встречались очень редко (5,0 %) и не на всех мазках, в отличие от пресноводных раков (40,0 %) [23] (рис. 4). Рис. 4. Соотношение форменных клеток гемолимфы Полугранулоциты занимают промежуточное положение у обоих видов, но у широкопалых речных раков данный форменный элемент встречался чаще (р > 0,05). Преобладающими клеточными элементами гемолимфы у австралийских раков были гранулоциты (57,0 %), их было значительно больше [23], чем у речных раков (27,8 %). Доля прозрачных клеток у австралийских раков составила 23 %, у речных раков этот форменный элемент гемолимфы меньше в 3 раза и составляет 8 %. Результаты сравнительного анализа клеточного состава гемолимфы австралийского красноклешневого рака Cherax quadricarinatus (Von Martens, 1868) демонстрируют таксономическую специфичность данного представителя пресноводной аквакультуры. Заключение Сбалансированный комбикорм при выращивании австралийских раков отвечал физиологическим потребностям объекта, что удовлетворительно отразилось на показателе темпа роста. Также был установлен высокий уровень биоиндикатора качества условий содержания – общего белка гемолимфы. При обзоре клеточных элементов гемолимфы по морфологическим признакам выделили четыре группы гемоцитов – агранулоциты (ГЦ I), полугранулоциты (ГЦ II), гра-нулоциты (ГЦ III) и прозрачные клетки (ГЦ IV). У австралийских раков агранулоциты встреча-лись очень редко и не на всех мазках, промежуточное положение занимают полугранулоциты, преобладающими клеточными элементами гемолимфы у австралийских раков являются грану-лоциты, что свидетельствует о таксономической специфичности вида и качественно отличает процентное соотношение клеточных элементов гемолимфы от такового у представителей речных раков.

References

1. Lagutkina L. Yu., Ponomarev S. V. Organicheskaya akvakul'tura kak perspektivnoe napravlenie rybohozyaystvennoy otrasli (obzor) // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. 2018. T. 53. № 2. S. 326–336.

2. Cultured Aquatic Species Information Programme Cherax quadricarinatus (von Martens, 1868). URL: http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Cherax_quadricarinatus/en#tcNA00FE (data obrascheniya: 22.01.2021).

3. Alecon. Razvedenie avstvraliyskogo raka. URL: http://alecon.co.il/article/ryba_uzv/razvedenie-krasnokleshnevogo-raka-akvakultura.html (data obrascheniya: 22.01.2021).

4. Koryagina N. Yu. Fiziologo-biohimicheskaya harakteristika rechnyh rakov pri vyraschivanii v iskusstvennyh usloviyah: avtoref. dis. … kand. biol. nauk. M.: Izd-vo RGAU MSHA, 2010. 21 s.

5. Alyakrinskaya I. O. O bufernyh svoystvah gemolimfy nekotoryh mollyuskov // Zoologich. zhurn. 1972. T. 1. № 2. S. 189–196.

6. Zhiteneva L. D., Poltavceva T. G., Rudnickaya O. A. Atlas normal'nyh i patologicheski izmenennyh kletok krovi ryb. Rostov n/D.: Rostov. knizh. izd-vo, 1989. 109 s.

7. Cherkashina N. Ya. Dinamika populyaciy rakov rodov Pontastacus i Caspiastacus (Crustacea, Decapoda, Astacidae) i puti ih uvelicheniya. M.: FGUP «Iacrybresurs», 2002. 257 s.

8. Aleksandrova E. H., Kocheva N. P. Prizhiznennoe opredelenie fiziologicheskogo statusa desyatinogih rakoobraznyh (Srustacea: Decapoda) po gematologicheskim pokazatelyam // Uspehi fiziologicheskih nauk. 2010. T. 41. № 2. S. 51–67.

9. Aleksandrova E. H., Belyakova V. I., Borisov P. P., Komarova E. A., Koryagina N. Yu., Pronina T. P. Kul'tivirovanie rechnyh rakov v nespusknyh vodoemah po pastbischnomu tipu // Sb. nauch. tr. GNU VNIIR i RGAU – MSHA im K. A. Timiryazeva po itogam Mezhdunar. nauch.-praktich. konf., posv. 60-letiyu Mosk. rybovodno-meliorativ. opytnoy stancii i VNIIR. M.: GNU VNII irrigacionnogo rybovodstva, 2005. T. 3. S. 86–95.

10. Pronina G. I., Koryagina N. Yu., Revyakon A. O. Sravnitel'naya ocenka rechnyh rakov raznyh vidov po biohimicheskim i gematologicheskim pokazatelyam // Izv. Orenburg. gos. agrar. un-ta. 2009. № 4 (24). S. 186–188.

11. Huiqun Chen, Shan Jin, Guoliang Wang, Juexiao Xie. Hemocytes and biochemical structure of blood at Portunus trituberculatus // Fish. Sei. 23. 2004. N. 6. P. 1–4.

12. Sean Taylor, Michael J. Landman. Flow Cytometric Characterization of Freshwater Crayfish Hemocytes for the Examination of Physiological Status in Wild and Captive Animals // Journal of Aquatic Animal Health. 2009. N. 21 (3). R. 195–203.

13. Lagutkina L. Yu., Ponomarev S. V. Marikul'tura. Kul'tivirovanie krevetok. Astrahan': Izd-vo AGTU, 2005. 72 s.

14. Stepanov R. V., Sheyhgasanov K. G., Lagutkina L. Yu., Mart'yanov A. S. Optimizaciya tehnologii kormleniya avstraliyskih rakov s pomosch'yu receptur eksperimental'nyh kormov // Vestnik Astrahanskogo gosudarstvennogo tehnicheskogo universiteta. Seriya: Rybnoe hozyaystvo. 2016. № 1. S. 77–87.

15. Lagutkina L., Nevalennyy A., Akhmedzhanova A., Ponomarev S., Fedorovykh Y. Viotech aspects of Saridean shrimp cultivation // 13th International Scientific and Practical Conference on State and Prospects for the Development of Agribusiness, INTERAGROMASH 2020: E3S Web of Conferences 175, 02003 (2020). URL: https://doi.org/10.1051/e3sconf/202017502003 (data obrascheniya: 22.01.2021).

16. Lagutkina L. Yu. Perspektivnoe razvitie mirovogo proizvodstva kormov dlya akvakul'tury: al'terna-tivnye istochniki syr'ya // Vestn. Astrahan. gos. tehn. un-ta. Ser.: Rybnoe hozyaystvo. 2017. № 1. S. 67–78.

17. Lagutkina L. Yu., Kuz'mina E. G., Biryukova M. G., Pershina E. V. Bioproduktivnost' prudov VI rybovodnoy zony // Vestn. Astrahan. gos. tehn. un-ta. Ser.: Rybnoe hozyaystvo. 2019. № 4. S. 87–94.

18. Lagutkina L. Yu., Kuz'mina E. G., Ahmedzhanova A. B., Taranina A. A., Yasinskiy V. S., Ponomarev R. A. Faktologicheskoe obespechenie praktik povysheniya effektivnosti vyraschivaniya tropicheskih presnovodnyh vidov // Vestn. Astrahan. gos. tehn. un-ta. Ser.: Rybnoe hozyaystvo. 2020. № 2. S. 94–105.

19. Filippovich Yu. B., Egorova T. A., Sevast'yanova G. A. Praktikum po obschey biohimii. M.: Prosveschenie, 1975. 318 s.

20. Fishbach F. T., Dunning M. B. A manual of laboratory diagnostic tests: 7thed. Lppincott Williams & Wilkins, 2004. 1291 p.

21. Soderhall K., Johansson M. W., Smith V. J. Internal Defence Mechanisms // Fresh-water crayfish. Biology, management and exploitation / edited by D. M Holdich and R. S. Lowery. Timber Press Portland, 1988. P. 213–235.

22. Kolb V. G., Kamyshnikov V. S. Klinicheskaya biohimiya: posobie dlya vrachey-laborantov. Minsk: Belarus', 1976. 311 s.

23. Ivanov A. A., Koryagina N. Yu., Pronina G. I., Revyakin A. O. Fiziologo-biohimicheskie adaptacii rechnyh rakov (Astacus astacus) pri izmenenii mineralizacii vodnoy sredy // Zootehniya. 2011. № 3. S. 120–128.

24. Ivanov A. A., Pronina G. I., Koryagina N. Yu., Revyakin A. O. Gomeostaz vnutrenney sredy gid-robiontov: vidovye osobennosti hladnokrovnyh // Izv. TSHA. 2013. № 3. S. 75–88.

25. Matishov G. G., Kokoza A. A., Metallov G. F., Geraskin P. P. Kompleksnyy podhod k probleme sohraneniya i vosproizvodstva osetrovyh ryb Kaspiyskogo morya. Rostov n/D.: Izd-vo YuNC RAN, 2017. 352 s.