CHANGES IN ONTOGENETIC PARAMETERS IN DAPHNIA MAGNA INFLUENCED BY SOLUTIONS OF BENZENE COMPOUNDS
Abstract and keywords
Abstract (English):
The article presents the research results of biological parameters of Daphnia magna development at the critical stages of ontogenesis influenced by the aqueous solutions of ecotoxicants: nitrobenzene and trichlorobenzene. The periods of reproduction and development in Daphnia magna are stated to be decisive, among other parameters (physiological, biochemical). In fact, the entire period of embryogenesis in Daphnia is quite vulnerable, compared to the further stages of development. Under the action of solutions of ecotoxicants taken for the research Daphnias have a decreased fertility and a delayed oogenesis. The next stage of sensitivity is the number of cast carapaces. The least sensitive parameter is the survival rate of adults. Increasing the remote toxic effect in three generations of Daphnias was not detected in the course of research. The Daphnia magna test object showed high sensitivity to nitrobenzene and trichlorobenzene acting as water environment pollutants in all the experiments. For the main ontogenetic parameters in the assessment of water quality it is preferable to take fecundity and violation of development processes at the pre-natal stages of Daphnia magna. According to the survival parameter, the maximum permissible concentration of the studied benzene compounds was 0.01 mg/l, which was determined by the most sensitive parameters and critical stages of ontogenesis

Keywords:
hydrobionts, toxicant, test object, Daphnia, nitrobenzene, trichlorobenzene, acceptable concentration
Text
Publication text (PDF): Read Download

Введение Изучение индивидуального развития гидробионтов в настоящее время заключается в исследовании процессов межклеточного взаимодействия, от которого и зависит как поведение, так и положение клеток в теле развивающейся особи гидробионта. Множество научных работ, появившихся в последние годы, подчеркивает важность взаимодействия целого ряда развивающихся систем в организме, однако механика развития организма как единого целого еще недостаточно исследована и не раскрыта с достаточной полнотой. Вплоть до настоящего времени большая часть научных исследований была сосредоточена на изучении биохимических процессов развития, но не уделяла достаточного внимания особенностям развития организма как целостной биологической системы [1]. Значительные усилия были затрачены учеными на изучение и выявление биохимии развития, например синтеза нуклеиновых кислот и белков, при этом причинно-следственному анализу сил, управляющих взаиморасположением клеток, уделялось неоправданно мало внимания [2]. Однако в развитии любого организма взаимодействие клеток, тканей и органов является одним из важнейших факторов: обусловленные воздействием вредных веществ, нарушения развития пагубно влияют не только на отдельные клетки, как это характерно при мутагенезе, но и на популяцию клеток. Согласованное развитие систем как у отдельных особей гидробионтов, так и в рамках биоценоза представляет собой сложнейшую цепь биологических, биохимических, физико-химических реакций, комплексное исследование и осмысление которых на сегодняшний день невозможно даже при наличии и применении передовых методов математического и компьютерного моделирования [3]. Ключевым признаком, указывающим на возможное нарушение взаимосвязей в отдельно взятом организме, могут стать морфологические изменения в органах и тканях исследуемого организма и, в перспективе, снижение темпа размножения особей в последующих поколениях. Наиболее важным в водной токсикологии оказывается изучение эмбриональных стадий онтогенеза гидробионтов, в особенности периодов морфогенетических сдвигов и изменения формообразующих регуляций. Например, у рыб отмечены характерные сдвиги с повышением чувствительности особей к токсичным соединениям на этапах гаструляции, выклева и начала работы сердца [4]. Целью настоящего исследования было проведение оценки токсичности растворов нитро-бензола и трихлорбензола с установлением максимально допустимых концентраций (МДК) для экотоксикантов, попадающих в рыбохозяйственные водоемы со стоками. Материал и методы исследований В качестве тест-объекта были взяты планктонные ракообразные Daphnia magna. Был по-ставлен ряд кратковременных опытов токсикологического характера, длительность которых составляла 48 и 96 ч. Также были проведены хронические опыты [5]. Культивация Daphnia magna проводилась по стандартным методикам [6]. Для контроля использовалась отстоянная вода объемом 200 мл, для эксперимента – вода с добавлением токсичных веществ в разной концентрации [7, 8]. В опыте была использована синхронизированная культура 1-2-дневных Daphnia magna, что позволяет исключить естественную убыль тест-объектов, т. к. длительность опыта составляла 30 сут, а продолжительность жизни Daphnia magna – 45 сут. Культивирование происходило при оптимальных температурах в диапазоне 19–21 °С, при этом особое внимание было уделено процессу стандартизации процедуры кормления и световых условий. В качестве осветительных приборов использовались приборы дневного света с реле со световым режимом 1 : 1. Опыты проводились в 3-кратной повторности. Кормление тестируемых дафний осуществлялось пекарскими дрожжами и хлореллой. В рецептуру корма входили подсушенные дрожжи, смешанные с водой из расчета 1 % дрожжей на стакан воды (тест-стакан объемом 200 мл). Эта суспензия по 3–5 капель вносилась в культуру с Daphnia magna. Хлореллу, из расчета 2 мл/л, вносили из культуры с плотностью 25–35 тыс. кл./мл. Культивирование хлореллы осуществлялось с использованием щелочной питательной среды Тамия (с содержанием мочевины, воды, фосфорнокислого калия, сернокислого магния, микроэлементов и т. д), после чего клетки отделяли от культуральной среды с помощью центрифугирования. Полученный осадок разводили некоторым количеством воды и хранили в охлажденном состоянии. Кормление хлореллой осуществлялся ежедневно, а пекарские дрожжи вносились в стаканы с тестовыми Daphnia magna 2 раза в неделю. Данные условия культивирования, при их соблюдении, гарантировали размножение Daphnia magna только партеногенезом. В рыбохозяйственные водоемы чаще всего попадают вещества различных классов опасности [6, 7], по этой причине для исследований были применены тестовые загрязняющие вещества различных классов опасности – нитробензол и трихлорбензол, – использование которых регламентируется и регулируется государством [9, 10]. Нитробензол. Органическое вещество, токсичное, с резким миндальным запахом, 4-го класса опасности. Оказывает вредное воздействие на кровяные клетки и приводит к образова-нию метгемоглобина, вызывает эффект помутнения сознания, причем эффекты воздействия могут быть отсроченными. При длительном воздействии нитробензола возможно воздействие на кроветворные органы организма, а также на печень [11]. В рамках исследования на Daphnia magna были взяты концентрации в остром опыте: 0,2; 0,1 и 0,01 мг/л. Поскольку концентрация 0,1 мг/л при сроке опыта в 96 ч дает предварительные результаты, близкие к LC50, спектр концентраций хронического эксперимента взят соответственно: 0,02; 0,01; 0,001; 0,0001 мг/л. Трихлорбензол. Компонент различных диэлектрических жидкостей. Вещество 3-го класса опасности. Вещество применяется в лакокрасочной промышленности и для получения взрывча-тых веществ, для производства красителей, гербицидов, теплоносителей, трансформаторных масел. Вызывает наркотическое состояние, довольно сильно угнетает дыхание, обладает нерезко выраженным действием раздражающего характера на слизистые оболочки зрительной системы и дыхательных путей [11]. В остром опыте, при концентрации трихлорбензола 0,1 мг/л, гибель дафний составила около 30 % от контроля. Исходя из этого наибольшая концентрация трихлорбензола для хрони-ческого опыта была выбрана равной 0,03 мг/л. Спектр концентраций для хронических опытов найден в опытах с установлением ЛК50, принят: 0,03; 0,01; 0,001; 0,0001 мг/л. Для исходного поколения и для последующих 3-х поколений Daphnia magna определялись биологические показатели. В связи с зафиксированным сдвигом между поколениями в 7 дней, для каждого поколения контроль ставился индивидуально. Достоверность разности средних определялась по критерию Стьюдента р ≥ 0,95. Результаты исследований Тестируемые бензольные соединения при их попадании в среду вызывали деструктивные нарушения биологических показателей Daphnia magna, связанные с размножением. Нитробензол. Нитробензол, как показали тесты, при концентрации, превышающей 0,1 мг/л, начинает отрицательно влиять на биообъекты (Daphnia magna) уже с первых же суток после постановки опыта. На 4-е сутки эксперимента зафиксирована гибель 40 % дафний. Отличительной особенностью действия нитробензола оказалось его влияние на поведенческие реакции дафний: за несколько часов до гибели была отмечена потеря дафниями ориентации в пространстве, характерные переворачивания через голову и опускание на дно тестовой емкости, при этом тело дафний приобретает мутный оттенок. При концентрации 0,1 мг/л не отмечено изменений по сравнению с контролем – таким образом, ее можно считать максимально допу-стимой. При изучении отсроченного воздействия нитробензола на тест-объекты были исследованы онтогенетические показатели в 3-х поколениях. Динамика развития дафний на протяжении 3-х поколений является объективным показателем, необходимым для выявления токсического воздействия нитробензола на генетическую экспрессию и генетический аппарат Daphnia magna в целом. Необходимо обратить внимание на то, что возрастная разница между поколениями со-ставила от 7 до 8 дней, что указывает на отсутствие у нитробензола токсических свойств, спо-собных затормозить овогенез и скорость созревания Daphnia magna. В хроническом опыте с максимальной концентрацией в 0,1 мг/л погибло более 60 % от общего количества тест-объектов, кроме того, необходимо отметить и повышенную гибель их эмбрионов. Данные о действии нитробензола на онтогенетические показатели у дафний пред-ставлены в табл. 1. Таблица 1 Онтогенетические показатели Daphnia magna под влиянием растворов нитробензола в хроническом эксперименте Концентрация токсиканта, мг/л Биологические показатели Выживаемость особей (за 30 сут), % Половозрелость особей, сут Первый помет, шт. Количество сброшенных карапаксов (на 10 дафний), шт. Плодовитость дафний (в пересчете на 1 самку), шт. Исходные особи Daphnia magna Контроль 94 ± 4,5 Половозрелые особи 87 ± 6,8 21,3 ± 4,1 0,0001 81 ± 15,1 91 ± 8,2 18,7 ± 2,1 0,001 92 ± 7,8 87 ± 12,3 22,5 ± 3,3 0,01 74 ± 11,4* 63 ± 12,2* 11,4 ± 1,8* 0,02 66 ± 15,3* 65 ± 7,2* 12,8 ± 2,3* I поколение Контроль 86 ± 8,2 8 10 94 ± 10,2 23,3 ± 1,8 0,0001 88 ± 11,3 8 9 91,2 ± 8,3 21,5 ± 1,6 0,001 92 ± 7,6 8 10 94 ± 11,2 23,5 ± 2,2 0,01 86 ± 12,1 8 9 90 ± 3,2 22,4 ± 2,4 0,02 75 ± 7,2* 8 9 74 ± 7,5* 21,3 ± 2,3 II поколение Контроль 95 ± 3,5 8 10 94 ± 6,2 21,2 ± 2,2 0,0001 100 8 10 87 ± 5,7 22,7 ± 1,7 0,001 85 ± 4,3 8 9 91 ± 5,8 19,5 ± 1,3 0,01 77 ± 11,2 8 9 85 ± 8,7 20,3 ± 1,4 0,02 63 ± 7,8* 8 9 75 ± 5,5* 17,5 ± 2,1* III поколение Контроль 100 8 9 100 ± 10,2 17,4± 2,3 0,0001 85 ± 10,2 8 10 99 ± 8,3 21,2 ± 1,4 0,001 99 7 10 98 ± 6,1 19,7 ± 2,5 0,01 88 ± 7,5 7 9 87 ± 8,8 16,5 ± 1,6* 0,02 77 ± 11,4* 8 9 86 ± 7,7* 11,3 ± 1,8* * Достоверная разница средних (р ≥ 0,95; tSt = 2,75; td = 2,45). Из анализа полученных в ходе эксперимента данных следует, что нитробензол макси-мально воздействует на исходное поколение Daphnia magna. Можно предположить, что у по-следующих поколений дафний вырабатывается некоторая адаптация к данному токсиканту, т. к. в последующих 3-х поколениях не зафиксировано статистически достоверной разницы между контрольной и опытной группами; в ходе эксперимента не отмечено отсроченного токсического воздействия нитробензола при концентрации 0,01 мг/л. Данная информация свидетельствует об адаптации Daphnia magna к токсическому воздействию нитробензола в процессе их развития, а концентрацию 0,01 мг/л допустимо принять за максимально допустимую. Трихлорбензол. Как следует из тестов, концентрации трихлорбензола 0,01 и 0,03 мг/л оказывают влияние на количество линек у Daphnia magna, что свидетельствует об интенсивном белковом обмене. Логично предположить, что это нарушение является онтогенетическим показателем, связанным с ростом особей. При температурах от 18–20 °С дафнии линяют 4–5 раз до периода созревания. Вместе с этим показатель линьки дафний является менее чувствительным по сравнению с прочими, например, с размножением дафний. Аналогичное явление можно отметить и в первом поколении дафний; в следующих поколениях схожее действие трихлобензола не наблюдалось. Необходимо отметить, что при концентрации трихлорбензола в 0,01 мг/л на одну особь приходилось только 0,2 эфиппия, таким образом, данную концентрацию и следует считать допустимой. Сведения о действии растворов три-хлорбензола на онтогенетические показатели Daphnia magna представлены в табл. 2. Таблица 2 Онтогенетические показатели Daphnia magna под влиянием растворов трихлорбензола в хроническом эксперименте Концентрация токсиканта, мг/л Биологические показатели Выживаемость особей (за 30 сут), % Половозрелость особей, сут Первый помет, шт. Количество сброшенных карапаксов (на 10 дафний), шт. Плодовитость дафний (в пересчете на 1 самку), шт. Исходные особи Daphnia magna Контроль 98 ± 3,2 Половозрелые особи 88 ± 7,2 22,4 ± 1,8 0,0001 85 ± 12,3 91 ± 9,5 21,7 ± 2,2 0,001 93 ± 8,2 86 ± 7,4 21,1 ± 1,6 0,01 75 ± 14,5* 58 ± 5,7* 12,4 ± 2,7* 0,03 68 ± 8,6 51 ± 8,5 13,5 ± 2,2 I поколение Контроль 94 ± 4,6 8 10 100 ± 5,5 21,5 ± 2,7 0,0001 91 ± 8,5 7 9 99 ± 8,7 22,9 ± 2,3 0,001 93 ± 5,7 7 10 97 ± 4,5 21,1 ± 1,8 0,01 87 ± 12,3 8 9 95 ± 7,3 21,4 ± 1,8 0,03 86 ± 11,2 8 8 99 ± 10,5 21,0 ± 3,3 II поколение Контроль 97 ± 2,4 7 8 82 ± 7,8 19,3 ± 2,0 0,0001 88 ± 10,2 7 10 84 ± 10,2 21,0 ± 1,6 0,001 93 ± 6,5 8 8 87 ± 9,5 21,5 ± 2,3 0,01 94 ± 4,7 7 8 82 ± 8,2 20,4 ± 2,1 0,03 92 ± 6,3 6 9 86 ± 7,3 21,2 ± 1,7 III поколение Контроль 100 9 10 100 ± 7,7 21,5 ± 2,2 0,0001 97 ± 5,5 8 11 99 ± 6,4 19,3 ± 1,5 0,001 99 8 9 97 ± 5,3 20,6 ± 1,4 0,01 90 ± 9,5 9 10 95 ± 5,8 19,8 ± 2,2 0,03 88 ± 8,2 8 10 96 ± 6,3 20,7 ± 1,2 * Достоверная разница средних (р ≥ 0,95; tSt = 2,75; td = 2,63). В качестве характерной черты действия на дафний у испытуемых токсикантов выступает токсичность в острых опытах, которая является наименьшей. Так, при концентрации 0,1 мг/л трихлорбензола гибель Daphnia magna составила 30 % тестовых особей за 98 ч, в то время как в среде с нитробензолом в качестве токсиканта гибель Daphnia magna была равной 40 % особей от тестового количества. В хроническом опыте при концентрациях трихлорбензола 0,01 мг/л гибнет от 20 до 30 % тестовых экземпляров, при концентрациях 0,001 и 0,0001 мг/л процент ги-бели практически не отличается от контроля. Аналогично ситуации с нитробензолом следующие 3 поколения дафний оказываются устойчивыми к токсическому воздействию трихлорбензола. Наибольшее воздействие трихлор-бензол оказывает не первое поколение тест-организмов; для 2-х следующих поколений Daphnia magna отклонения статистически минимальны (табл. 2). В связи с этим за максимально допу-стимую концентрацию трихлорбензола может быть принята концентрация 0,01 мг/л. Обсуждение результатов Нитробензол и трихлорбензол по своему действию на живые организмы являются ярко выраженными токсикантами, воздействуя на такие системы позвоночных животных, как крове-носная и нервная системы. Под воздействием нитробензола и трихлорбензола кровь тест-объектов может подвергаться гемолизу [12]. Исследования, проведенные лабораторным способом на млекопитающих, позволили установить лимитирующие показатели токсичности: для нитробензола ПДК 0,02 мг/л, а для трихлорбензола ПДК в питьевой воде – 0,03 мг/л. Отмечается при этом, что низшие позвоночные наименее устойчивы к воздействию хлорсодержащих соединений по сравнению с млекопитающими и птицами. Необходимо отметить повышенную чувствительность эмбриональных стадий развития организмов к токсикантам, а следовательно, и к загрязнению окружающей среды. Н. С. Строга-нов считал выживаемость объективным критерием острого отравления. Под действием малых доз токсикантов организм может быть жизнеспособен достаточно продолжительное время, но, скорее всего, у него будет нарушена репродуктивная функция либо будет происходить нарушение развития организма, с получением в дальнейшем неполноценного потомства [13]. Критерии развития и размножения гидробионтов весьма деликатные, поэтому на современном уровне развития техники и технологий их невозможно прогнозировать. Однако это позволяет сделать биологический анализ, и сегодня он положен в основу ряда прогрессивных токсикологических методик (установление МДК на каждом рыбохозяйственном объекте, предшествующее рыбохо-зяйственной ПДК) [4]. Наиболее важным инструментом в этой области, которая уже выделилась в самостоятельное направление, называемое экспериментальной тератологией, является возможность устанавливать отдаленный биологический эффект действия токсических веществ, попадающих в окружающую среду в малых концентрациях. Именно чувствительность водных организмов на стадии развития предопределила их использование в водной токсикологии в качестве биологических тестов [2]. Существующие в настоящее время биологические исследования демонстрируют высокую исследовательскую эффективность изучения эмбриональных стадий развития гидробионтов в целях установления различных критериев токсичности при загрязнении водной среды, вместе с чем открываются и новые возможности для экспресс-исследований токсичности [14]. Особенностью развития дафний является сложная многофакторная система взаимосвязей, сопровождающих их жизненно важные функции на различных этапах жизни; по взаимосвязанным реакциям и морфологическим изменениям у данных организмов, например, целесообразно судить о степени токсичности исследуемого вещества. Однако для Daphnia magna еще только предстоит исследовать многие особенности развития и размножения. Плодовитость Daphnia magna, по различным данным, колеблется от 30 до 55 особей на одну самку, размеры личинки – около 0,5 мм, личинки созревают за 3–4 дня и дают иногда до 7 пометов каждые 1–2 дня, при этом изменение плодовитости зависит не только от условий среды и кормления, но и от сезонности [13]. У Daphnia magna, по имеющимся данным, есть 2 периода резкого понижения плодовито-сти: ноябрь–январь и июнь–июль. Daphnia magna хорошо себя чувствуют и размножаются при концентрации бактерий не менее 1 млн в 1 см3 воды. Однако при численности бактерий менее 500 тыс. на 1 см3 наступление половозрелости дафний несколько задерживается; если численность бактерий ниже 200 тыс. на 1 см3, жизнь Daphnia magna становится невозможной [15]. Важнейшая особенность Daphnia magna состоит в том, что они ракообразные с высоким темпом размножения: цикл их жизни короткий, но они могут существовать при достаточно высоких плотностях. Знание же нормального развития и особенностей размножения низших ракообразных при испытании токсической активности веществ и установлении ПДК принципиально необходимы, т. к. существует еще много малоизученных аспектов, в первую очередь у Daphnia magna. Загрязнение водоемов может привести к нарушению экологического равновесия за счет гибели (резкого уменьшения) популяций гидробионтов-фильтраторов, входящих в кормовую базу различных видов рыб, может наблюдаться подавление процессов самоочищения воды [15]. Выводы Анализ развития низших ракообразных в загрязненной среде свидетельствует о том, что периоды размножения и развития у Daphnia magna являются решающими среди прочих показателей (физиологических, биохимических). Фактически весь период эмбриогенеза у дафний является достаточно уязвимым по сравнению с дальнейшими этапами развития. У дафний при действии растворов выбранных для исследования экотоксикантов в первую очередь снижается плодовитость и происходит задержка оогенеза, затем, по чувствительности, отмечается количество сброшенных карапаксов, и наименее чувствительный параметр – выживаемость взрослых особей. Усиление отдаленного токсического эффекта в трех поколениях дафний выявлено не было. Выбранный тест-объект Daphnia magna во всех наших опытах (в том числе и в хронических) показал высокую чувствительность к данным загрязнителям водной среды. За основные онтогенетические параметры в оценке качества вод предпочтительно брать такие показатели Daphnia magna, как плодовитость и нарушение процессов развития на предзародышевых стадиях. По параметру «выживаемость» нами выявлены максимально допустимые концентрации (МДК) исследуемых бензольных соединений – 0,01 мг/л. Практическое применение результатов: использование МДК для разработки эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК) для токсичных бензольных соединений, поступающих со сточными водами промышленных предприятий в окружающую среду и совершенствование методов определения допустимых концентраций токсикантов в водной среде за счет выявления их действия на наиболее чувствительные периоды онтогенеза тест-объектов.

References

1. Nikiforov-Nikishin A. L. Morfologicheskie osobennosti hrustalika gidrobiontov i ih primenenie v vodnoy toksikologii: dis. … d-ra biol. nauk. M.: Izd-vo MGUTU, 2005. 256 s.

2. Filenko O. F. Vodnaya toksikologiya. M.: Izd-vo MGU, 1988. 154 s.

3. Apter M. Kibernetika i razvitie. M.: Mir, 1970. 216 s.

4. Stroganov N. S., Putincev A. I., Isakova E. F., Shigin V. I. Metod toksikologicheskogo kontrolya stochnyh vod // Biol. nauki. 1979. № 2. S. 90–96.

5. Metodicheskie rekomendacii po biotestirovaniyu prirodnyh, stochnyh vod i otdel'nyh zagryaznyayuschih veschestv. M.: Izd-vo VNIRO, 1982. 33 s.

6. Ob utverzhdenii Metodicheskih ukazaniy po razrabotke normativov kachestva vody vodnyh ob'ektov rybohozyaystvennogo znacheniya, v tom chisle normativov predel'no dopustimyh koncentraciy vrednyh veschestv v vodah vodnyh ob'ektov rybohozyaystvennogo znacheniya: Prikaz Federal'nogo agentstva po rybolovstvu ot 04 avgusta 2009 g. № 695 (s izm. ot 22 dekabrya 2016 g.). URL: http://docs.cntd.ru/document/902172637 (data obrascheniya: 12.09.2020).

7. RD 52.24.669-2005. Unificirovannye metody biotestirovaniya dlya obnaruzheniya toksicheskogo zagryazneniya poverhnostnyh vod sushi s ispol'zovaniem mikrozooplanktona. M.: GU CKB GMP, 2005. 28 s.

8. Avilova G. A., Karpuhina E. A. Benzol. M.: Centr GKNT, 1985. 45 s.

9. Ob utverzhdenii normativov kachestva vody vodnyh ob'ektov rybohozyaystvennogo znacheniya, v tom chisle normativov PDK vrednyh veschestv v vodah vodnyh ob'ektov rybohozyaystvennogo znacheniya: Prikaz Minsel'hoza Rossii ot 13 dekabrya 2016 g. № 552 (s izm. ot s 27 iyunya 2020 g.). URL: http://docs.cntd.ru/document/420389120 (data obrascheniya: 13.09.2020).

10. Bol'shaya enciklopediya nefti i gaza. URL: https://ngpedia.ru/id450175p1.html (data obrascheniya: 13.09.2020).

11. Kiper R. A. Svoystva veschestv: sprav. Habarovsk: Izd-vo Dal'nevostoch. gos. gumanit. un-ta, 2009. 387 s.

12. Kancerogennye veschestva: sprav. M.: Medicina, 1986. 332 s.

13. Sotnikov F. I. Kriticheskie periody v rannem ontogeneze gidrobiontov i ih rol' v biotestirovanii i ekologo-rybohozyaystvennom normirovanii: dis. … kand. biol. nauk. M.: Izd-vo MGUTU, 2005. 148 s.

14. Filenko O. F. Opyt primeneniya model'nyh vodnyh ekosistem dlya resheniya issledovatel'skih zadach // Biologicheskie processy zagryaznennyh model'nyh vodoemov. M.: Izd-vo MGU, 1984. S. 174–192.

15. Artyuhova V. I., Dmitrieva A. G. i dr. Monitoring vod rek Podmoskov'ya metodami biotestirovaniya // Vodnye resursy. 1991. № 1. S. 115–121.