Russian Federation
Russian Federation
The article considers the use of salicylic acid as a stimulator of microalgae growth. The influence of a wide range of salicylic acid concentrations on the growth dynamics of Tetra-selmis suecica in enrichment culture has been evaluated. Cultivation was carried out in monoculture. An increase in algal biomass was measured by the increasing number of cells counted in each experiment in three Goryaev chambers under a light microscope. The duration of the experiments was 14 days. It is shown that salicylic acid in concentrations of 0.4-1.9 • 10–5 M inhibits the growth of algae. The growth of the control culture has two pronounced peak numbers on 4th and 12th days of the experiment. The introduction of salicylic acid in concentrations of 0.44-1.9 • 10–5 M was accompanied by a change of the growth curves: the maximum number of cells was observed on 12th day of the experiment. A higher concentration of phytohormone (3.75.• 10–5 M) provided an increase in crop density by 414% over 14 days of the experiment. The growth of T. suecica culture in the control group was 332%. The values of the specific growth rate of T. suecica were calculated for different periods of cultivation. After 14 days of the experiment, the biochemical composition of the microalgae biomass was evaluated, which showed stimulation with salicylic acid at a con-centration of 3.75 • 10–5 M carbohydrate accumulation. The high concentration of phytohormone suppressed the accumulation of protein, lipids and chlorophyll in the culture and stimulated the accumulation of carbohydrates. It has been suggested that a possible mechanism for the multidirectional action of salicylic acid is its effect on synthesis and catabolism through inhibition of the synthesis and metabolism of endogenous plant hormones.
enrichment culture, microalgae, salicylic acid, growth rate, chemical composition, carbohydrates, lipids, protein, chlorophyll
Введение Большинство коммерчески эксплуатируемых видов микроводорослей находят свой основной рынок сбыта в аквакультуре в качестве корма для рыб, личинок, молоди моллюсков и ракообразных [1]. Знание химического состава микроводорослей, выращенных в контролируемых и стандартизированных условиях, является первым шагом к пониманию и продвижению потенциальных возможностей биомассы микроводорослей в качестве пищевой добавки или ингредиента. Морская микроводоросль Tetraselmis suecica применяется в аквакультуре в качестве корма для культивируемых беспозвоночных [2–4]. В последнее время проявляемый интерес к этому виду микроводорослей связан с ее использованием в качестве сырья для производства биотоплива и в качестве источника получения высокоэффективных биологически активных веществ для нутрицевтики, фармацевтики и косметической промышленности [5, 6]. Регуляторы роста широко применяются в сельскохозяйственном растениеводстве для регуляции роста растений в сельскохозяйственной практике. К природным регуляторам относят фитогормоны. К гормонам растений также относят салициловую кислоту. По химической природе салициловая кислота является фенолом. Известна роль салициловой кислоты в формировании индуцированной устойчивости высших растений, основанной на ее способности ингибировать ферменты антиоксидантной защиты растений [7]. Сведения о гормональной системе водорослей фрагментарны и касаются главным образом макрофитов [8]. Физиологическая роль фитогормонов у водорослей различных таксонов значительно варьирует [9, 10]. О синтезе и роли салициловой кислоты у микроводорослей данные в доступной литературе отсутствуют. Исследования фитогормонов микроводорослей, являющихся пищевыми объектами моллюсков и беспозвоночных, единичны и касаются в основном разработки методов их культивирования с целью извлечения биологически активных метаболитов (каротиноидов, хлорофиллов). Остаются малоизученными вопросы влияния экзогенных стимуляторов роста на культуры микроводорослей, их биохимический состав. В то же время знание физиологических эффектов действия фитогормонов открывает промышленную перспективу их использования в марикультурных хозяйствах. Целью работы являлось исследование влияния экзогенной салициловой кислоты на ростовые и биохимические характеристики микроводоросли Tetraselmis suecica, являющейся при-родным кормом объектов марикультуры. Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи: – выявить зависимость динамики роста микроводоросли Tetraselmis suecica от различных концентраций салициловой кислоты в накопительной культуре; – исследовать влияние салициловой кислоты на биохимические показатели микроводорослей: содержание углеводов, белка, липидов, хлорофиллов. Материалы и методы В качестве исходного материала для культивирования была использована альгологически чистая культура Tetraselmis suecica из коллекции Научно-производственного департамента марикультуры ФГБОУ ВО «Дальрыбвтуз». В качестве культиваторов использовали одноразовые полиэтиленовые рукава объемом 40 л. Микроводоросли выращивали в накопительном режиме на питательной среде Гольдберга, содержащей такие соли, как KNO3, Na2PO4, FeCl3 • 6H2O, MnCl2 • 4H2O и CoCl2 • 6H2O [11]. Культура водорослей содержалась при температуре 21–23 °С, освещенности 8–10 клк, фотопериоде 8 : 16 ч (свет : темнота) и круглосуточной аэрации. В качестве стимулятора роста использовали салициловую кислоту («НеваРеактив», Рос-сия). Культивирование осуществляли в монокультуре. Прирост биомассы водорослей находили по увеличению числа клеток, просчитанных в каждом опыте в трех камерах Горяева под световым микроскопом. Продолжительность экспериментов составляла 14 дней. Расчет удельной скорости роста микроводоросли проводили по Р. П. Тренкешу (2019) [12]. Общее содержание углеводов оценивали по образованию окрашенного зеленого соединения с максимумом поглощения при 625 нм в результате реакции гидроксиметилфурфурола, который образуется при гидролизе глюкозы в горячей кислой среде, с антроновым реактивом [13]. Для определения количественного содержания белка отбирали 10 мл культуры водоросли, центрифугировали при 5 000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, полученный осадок замораживали и хранили при –20 °С. К осадку добавляли 10 мл 1-молярного раствора NaОН и выдерживали на водяной бане при 100 °С в течение 5 мин [14], предварительно однократно обработав образцы ультразвуком при 50 % мощности в течение 30 с. Полученный экстракт центрифугировали при 5 000 об/мин в течение 5 мин. В надосадочной жидкости про-водили определение белка методом Лоури [15]. Сумму хлорофиллов выделяли методом экстракции ацетоном из предварительно замороженной биомассы водорослей [16]. Количественное содержание хлорофиллов определяли спектрофотометрически при длинах волн 630, 647, 664 и 750 нм. В качестве контроля использовали 90 % ацетон. Расчет содержания хлорофиллов a, b и с проводили по формулам, приведенным в [17]. Сумму липидов экстрагировали по методу Фолча [18]. Количество липидов в микроводоросли определяли гравиметрически. Результаты и обсуждение Рост Tetraselmis suecica в накопительной культуре характеризовался линейностью. Плотность культуры в среднем увеличивалась от 0,66 до 1,9 млн кл./мл через 14 дней культивирования. Следует отметить, что в период с 12 по 14 день рост культуры замедлился и в среднем со-ставил 0,2 млн кл./мл (рис. 1, группа «контроль»). Рис. 1. Влияние различных концентраций салициловой кислоты (10–5 моль) на рост культуры Tetraselmis suecica Была проведена оценка влияния различных концентраций салициловой кислоты на рост в накопительной культуре Tetraselmis suecica. Оценка роста биомассы проводилась по показателям количества клеток в мл культуральной среды. По результатам исследования установлено, что салициловая кислота в концентрациях 0,99 10–5 моль практически не оказывала влияния на темп роста микроводоросли. Концентрации фитогормона 0,4 и 1,9 10–5 моль ингибировали рост микроводоросли. Только в концентрации 3,75 10–5 моль салициловая кислота стимулировала рост количества клеток микроводоросли. Следует также отметить, что на 12 сутки эксперимента количество клеток в контроле и экспериментальных группах, содержащих 0,99 10–5 и 3,75 10–5 моль фитогормона оказалось одинаковым. Из оценки роста количества клеток T. suecica в течение всего эксперимента следует, что плотность культуры в контрольной группе увеличилась на 332,8 % (рис. 2). Рис. 2. Влияние различных концентраций салициловой кислоты (10–5 моль) на прирост культуры Tetraselmis suecica При использовании салициловой кислоты в концентрациях от 0,4 до 1,99 10–5 моль рост плотности культуры составлял 197,5–322,3 % от исходных значений. В то же время внесение в культуральную среду салициловой кислоты до концентрации 3,75 10–5 моль приводило к стимуляции роста до 414,7 % от исходных значений. Таким образом, разница темпов роста в этой группе, по сравнению с контрольной, составляла 81,9 %. Кривые роста культур за весь период эксперимента (см. рис. 1) не имеют линейной зависимости. Исходя из представленных данных не представляется возможным рассчитать удельную скорость роста без выявления ее логарифмической фазы. Была проведена оценка прироста клеток микроводорослей «по нарастающей» за весь период эксперимента (рис. 3). Рис. 3. Влияние различных концентраций салициловой кислоты (10–5 моль) на ежесуточный прирост клеток культуры Как видно из рисунка, рост контрольной культуры имеет два выраженных пика численности: на 4-й и 12-й дни эксперимента. Внесение салициловой кислоты в концентрациях 0,44–1,9 10–5 моль сопровождалось изменением характера кривых роста: максимум количества клеток в большинстве случаев отмечался на 12-й день эксперимента. Кривая прироста культуры при внесении салициловой кислоты в концентрации 3,75 10–5 моль, как и в контрольной группе, имела два максимума – на 6-й и 12-й дни. Следует отметить, что во всех экспериментальных группах культивирование с 12-го по 14-й день сопровождалось резким снижением прироста количества клеток микроводоросли. Исходя из представленных на рис. 3 данных были рассчитаны значения удельной скорости роста T. suecica в различные периоды культивирования (табл. 1). Таблица 1 Влияние различных концентраций салициловой кислоты на удельную скорость роста Tetraselmis suecica Концентрация салициловой кислоты, 10–5 моль Удельная скорость роста, µ, сутки–1 1–4 день 8–12 день Контроль 0,092 0,089 0,4 0,003 0,058 0,99 0,055 0,08 1,9 0,029 0,075 3,75 0,085 0,062 Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что удельная скорость роста T. suecica в контрольной группе не различалась в разные периоды роста. В то же время удельная скорость роста культуры микроводоросли значительно увеличивалась при внесении в культуральную среду салициловой кислоты в концентрациях 0,4–1,9 10–5 моль. Использование максимальной концентрации стимулятора (3,75 10–5 моль), наоборот, приводило к снижению удельного роста на 8–12 дни эксперимента. Разнонаправленность эффектов действия различных концентраций салициловой кислоты связано, предположительно, с ее регуляторными свойствами. Считается, что салициловая кис-лота может вызывать торможение ростовых процессов через механизм ингибирования других фитогормонов – индолилуксусной кислоты – либо стимуляции синтеза ИУК-оксидазы [19]. Например, для каллусной культуры табака Nicotiana tabacum ингибирующая концентрация салициловой кислоты составляла 10–3 моль/л, стимулирующая концентрация – 10–5 моль/л [20]. После 14 дней эксперимента была проведена оценка биохимического состава биомассы микроводорослей (табл. 2). Таблица 2 Показатели состава биомассы Tetraselmis suecica Показатель Контроль Экспериментальная группа (салициловая кислота 3,75 10–5 моль) Углеводы, % 32,4 46,8 Белок, % 38,7 29,3 Липиды, % 6,3 2,9 Хлорофилл, мкг/мл 15,5 8,8 Из представленных в табл. 2 данных видно, что салициловая кислота в концентрации 3,75 ∙ 10–5 моль стимулировала накопление углеводов: содержание углеводов в экспериментальной группе было на 14 % больше по сравнению с контрольной группой. В то же время в биомассе микроводорослей экспериментальной группы отмечено снижение содержания белка на 9,4 %, липидов на 3,4 %, хлорофилла в 1,8 раза. Белки растений по отношению к салициловой кислоте условно разделяют на группы в зависимости от количества и включения в их состав 14С-аминокислот [21]. К СК-зависимым белкам относят фосфоглицератмутазу, S-аденозилметионинсинтазу 3, енолазу, халконизомеразу, нуклеозиддифосфаткиназу 1 и тиоредоксин h. Ранее было показано влияние экзогенной салициловой кислоты на содержание общего белка на культивируемых клетках штамма Polyscias filici-folia [22]. Был выявлен дозозависимый эффект стимуляции (0,05 и 0,1 мкмоль/100 г сырой биомассы) и ингибирования (0,17 мкмоль/100 г сырой биомассы) накопления белка в культуре. Индукция биосинтеза белка в клетках каллуса отмечалась на фоне снижения его распада и увеличения времени функционирования [22]. Известна способность некоторых фитогормонов влиять на адаптацию, рост и развитие высших растений, а также развитие и покой семян. Так, в стареющих растениях количество АБК увеличивается, что вызывает деградацию белков и хлорофилла [23]. По-видимому, полученные нами данные о снижении содержания белка и липидов в куль-туре свидетельствуют о том, что концентрации салициловой кислоты 0,4–1,9 • 10–5 моль подавляют образование некоторых ферментов синтеза и катаболизма этих веществ. Выявленные изменения количественного состава белков и хлорофилла T. suecica свидетельствуют, по-видимому, о том, что этот гормон выполняет у микроводорослей те же функции, что и у высших растений. Заключение В результате исследования установлено, что салициловая кислота в различных концентрациях проявляет как индуцирующее, так и ингибирующее действие на рост культуры Tetraselmis suecica. При концентрации салициловой кислоты 3,75 10–5 моль рост культуры со-ставлял 415 % от исходных значений. В культуре без использования фитогормона рост составлял 332 %. Использование больших концентраций салициловой кислоты приводило к повыше-нию концентрации углеводов в биомассе водоросли и снижению концентрации белка, липидов и хлорофилла. Возможным механизмом разнонаправленного действия салициловой кислоты является ее влияние на синтез и катаболизм через ингибирование синтеза и метаболизма эндогенных гормонов растений.
1. Guedes A. C., Malcata F. X. Nutritional value and uses of microalgae in aquaculture // Aquaculture. 2012. January. P. 59-78.
2. Conceição L. E. C., Yúfera M., Makridis P., Morais S., Dinis M. T. Live feeds for early stages of fish rearing // Aquaculture Research. 2010. V. 41. P. 613-640.
3. Camacho-Rodríguez J., González-Céspedes A. M., Cerón-García M. C., Fernández-Sevilla J. M., Acién-Fernández F. G., Molina-Grima E. A. A quantitative study of eicosapentaenoic acid (EPA) production by Nannochloropsis gaditana for aquaculture as a function of dilution rate, temperature and average irradiance // Applied Microbiology and Biotechnology. 2014. V. 98. P. 2429-2440.
4. Chauton M. S., Reitan K. I., Norsker N. H., Tveterås R., Kleivdal H. T. A. A techno-economic analysis of industrial production of marine microalgae as a source of EPA and DHA-rich raw material for aquafeed: research challenges and possibilities // Aquaculture. 2015. V. 436. P. 95-103.
5. Reyimu Z., Özçimen D. Batch cultivation of marine micro-algae Nannochloropsis oculata and Tetraselmis suecica in treated municipal wastewater toward bioethanol production // Journal of Cleaner Production. 2017. V. 150. P. 40-46.
6. Sun Z., Wei H., Zhou Z. G., Ashokkumar M., Liu J. Screening of Isochrysis strains and utilization of a two-stage outdoor cultivation strategy for algal biomass and lipid production // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2018. V. 185. P. 1100-1117.
7. Vasyukova N. I., Ozereckovskaya O. L. Inducirovannaya ustoychivost' rasteniy i salicilovaya kislota (obzor) // Prikladnaya biohimiya i mikrobiologiya. 2007. T. 43. № 4. S. 405-411.
8. Tarahovskaya E. R., Maslov Yu. I., Shishova M. F. Fitogormony vodorosley // Fiziologiya raste-niy. 2007. T. 5. № 2. S. 186-194.
9. Romanenko E. A., Kosakovskaya I. V., Romanenko P. A. Fitogormony mikrovodorosley: biologicheskaya rol' i uchastie v regulyacii fiziologicheskih processov. Ch. I. Auksiny, abscizovaya kislota, etilen // Al'gologiya. 2015. T. 25. № 3. S. 330-351.
10. Romanenko E. A., Kosakovskaya I. V., Romanenko P. A. Fitogormony mikrovodorosley: biologicheskaya rol' i uchastie v regulyacii fiziologicheskih processov. Ch. ІI. Citokininy i gibberelliny // Al'gologiya. 2016. T. 26. № 2. S. 203-229.
11. Kabanova Yu. G. O kul'tivirovanii v laboratornyh usloviyah morskih planktonnyh diatomovyh i peridinievyh vodorosley // Tr. In-ta okeanologii Akad. nauk SSSR. 1961. T. 47. S. 203-216.
12. Trenkeshu R. P. Raschet udel'noy skorosti rosta mikrovodorosley // Morskoy biologicheskiy zhurnal. 2019. T. 4. № 1. S. 100-108.
13. Laurens L. M. L., Dempster T. A., Jones H. D. T., Wolfrum E. J., Wychen S. V., McAllister J. S. P., Rencenberger M., Parchert K. J., Gloe L. M. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries // Journal of Analytical Chemistry. 2012. V. 84. N. 4. P. 1879-1887.
14. Herbert D., Phipps P. J., Strange R. E. Chemical analysis of microbial cells // Methods Microbiol. 1971. N. 58. P. 209-344.
15. Lowry O., Rosenbrougt N., Parr A., Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent // Journal of Biological Chemistry. 1951. V. 193. N. 1. P. 265-276.
16. Sarneiro M., Pojo V., Malcata F. X., Otero A. Lipid accumulation in selected Tetraselmis strains // Journal of Applied Phycology. 2019. N. 31. P. 2845-2853.
17. Aminot A., Ray F. Standard procedure for the determination of chlorophyll a by spectroscopic methods // ICES techniques in marine environmental sciences. International Council for the Exploration of the Sea, 2001. 16 p.
18. Christie W. W. Lipid Analysis: Isolation, Identification and Structural Analysis of Lipids. England: The Oily Press, 2003. 416 p.
19. Westfall C. S., Muehler A. M., Jez J. M. Enzyme Action in the Regulation of Plant Hormone Responses // Journal of Biological Chemistry. 2013. V. 288. P. 19304-19311.
20. Ditchenko T. I., Yurin V. M. Regulyaciya rostovyh processov kallusnoy kul'tury Nicotiana tabacum pod deystviem ekzogennoy salicilovoy kisloty // Vestn. Belorus. gos. un-ta. Ser. 2. 2008. № 3. C. 72-76.
21. Tarchevskiy I. A., Yakovleva V. G., Egorova A. M. Vliyanie salicilovoy kisloty na soderzhanie belkov i vklyuchenie v nih 14S-aminokislot v kornyah goroha // Fiziologiya rasteniy. 2011. T. 58. № 4. S. 523-532.
22. Kirillova N. V., Belyh Yu. V., Spasenkova O. M. Vliyanie salicilovoy kisloty na obmen vnutrikletochnogo belka v kul'ture tkani Polyscias filicifolia // Butlerovskie soobscheniya. 2013. T. 34. № 4. S. 129-134.
23. Shu-Quing C., Rong-Xian Z., Wei L., Zhi-Rui D., Qi-Ming Z. The involvement of Cytokenin and Ab-scisic acid levels in roots in the regulation in flag levels during grain filling in supper high-yielding Rice (Oryza sativa) // Journal of Agronomy and Crop Science. 2004. V. 190. P. 73-80.
