Abstract and keywords
Abstract (English):
A significant part of the anthropogenic burden on surface water, are sewage containing surface-active substances (SAS), which are part of all domestic and most industrial sewage. For the treatment of domestic and industrial sewage from surface-active substances physico-chemical and biological methods are widely used. The aim of this study was to discharge from industrial wastes microorganisms – destructors of SAS. Pure cultures of microorganisms were isolated from oil sludge and waste water of oil and gas industry, wastewater of fiberglass production. Isolation of microorganisms from oil sludge and oil waste waters was carried out by cumulative microbial culture using liquid nutritive Chapek and CPYGG media. Microorganisms from industrial sewage of fiberglass production were isolated by Koch’s method in nutrient media M9 and MEA. To study the physiological and biochemical properties the needs of the bacterial strains in different sources of carbon, nitrogen, phosphorus, amylolytic, proteolytic, lipolytic, fungicidal, emulsifying activity, phytotoxicity and the ability to learn the basic components of waste waters were determined. The studies of industrial wastes in pure cultures there has been isolated 13 strains of bacteria, represented by gram-positive and gram-negative forms, belonging to the genera Bacillus, Pseudomonas, Kocuria, Stenotrophomonas, Proteus, Staphylococcus. The study of the physiological and biochemical properties showed that all isolates were able to assimilate carbon, nitrogen and phosphorus as the main sources of energy in organic and mineral form, to have proteolytic, lipolytic, emulsifying and fungicidal activity and to absorb the main components of waste waters. In the study of their destructive power to SAS it has been stated that all strains are capable to degradation of anionic and cationic SAS. It allows considering the possibility of using bacterial cultures to develop ways to clean water environments from SAS.

Keywords:
microorganisms, sewage, purification, surface-active substances, degradation
Text
Введение Важнейшая экологическая проблема современного мира – утилизация токсичных химических веществ, которые попадают в окружающую среду в составе промышленных и бытовых отходов. Наиболее распространенной и опасной группой ксенобиотиков являются поверхностно-активные вещества, которые широко применяются более чем в 100 отраслях промышленности, и, являясь активной основой бытовых и промышленных моющих средств, в большом количестве попадают в водную среду. При этом значительную часть антропогенной нагрузки, приходящейся на поверхностные водные объекты, составляют сточные воды, содержащие синтетические поверхностно-активные вещества (СПАВ), которые входят в состав всех хозяйственно-бытовых и большинства промышленных сточных вод. 95–98 % общего количества применяемых в России детергентов – синтетических моющих средств (CMC), вырабатываемых промышленностью, составляют анионные и неионогенные ПАВ и моющие средства на их основе, которые, как правило, характеризуются низкой биологической разлагаемостью и в силу своей химической природы оказывают существенное отрицательное воздействие на водные объекты. Попадая в водоемы, ПАВ активно участвуют в процессах перераспределения и трансформации других загрязняющих веществ (таких как хлорофос, анилин, цинк, железо, бутилакрилат, канцерогенные вещества, пестициды, нефтепродукты, тяжелые металлы и др.), активизируя их токсическое действие [1]. Анализ данных о биоразлагаемости ПАВ позволяет выделить следующие перспективные направления решения проблемы снижения воздействия данной группы токсикантов на окружающую среду: синтез и внедрение в производство легко биоразрушаемых соединений и разработка новых, более эффективных методов очистки окружающей среды от ПАВ. Для очистки бытовых и промышленных сточных вод от ПАВ широко используются физико-химические и биологические методы. Биологические методы очистки базируются на использовании потенциала гетеротрофных микроорганизмов, способных в качестве субстрата для роста и развития потреблять широкий круг органических соединений, в том числе и ПАВ различного происхождения. Так, в природе довольно часто встречаются микроорганизмы, способные разрушать биологически «мягкие» ПАВ, в том числе неионогенные, такие как оксиэтилированные спирты и кислоты, реже – «жесткие», такие как оксиэтилированные алкилфенолы. Известно, что чем больше ксенобиотики отличаются от природных субстратов и метаболитов основного обмена, тем меньше вероятность широкого распространения штаммов, способных к их утилизации. Вследствие попадания ПАВ в окружающую среду в естественных субстратах появляются микроорганизмы с повышенной устойчивостью к этим соединениям, многие из которых способны к их деструкции [2]. Такими объектами формирования устойчивых сообществ микроорганизмов являются загрязненные почвы, сточные воды и активные илы очистных сооружений. Тем не менее даже из таких источников не всегда удается выделить микроорганизмы-деструкторы. Совершенствование биотехнологии микробной очистки от ПАВ основано на селекции новых высокоактивных консорциумов или штаммов-деструкторов, исследовании и отработке условий и приемов их наиболее эффективного использования, поэтому получение чистых культур и сообществ микроорганизмов, имеющих высокие биодеструктивные характеристики в отношении этих соединений, представляет собой актуальную задачу. Целью исследований являлось выделение из промышленных отходов микроорганизмов – деструкторов ПАВ. Материалы и методы исследования Чистые культуры микроорганизмов выделяли из нефтешламов и замазученных сточных вод предприятий нефтегазовой отрасли, сточных вод производства стекловолокна. Выделение микроорганизмов из нефтешламов и замазученных сточных вод проводили методом накопительной микробной культуры с использованием жидких питательных сред Чапека и СРYGG [3]. Для этого в колбы Эйленмейера вносили жидкую среду в количестве 100 мл с добавлением 10 г нефтешлама или 10 мл замазученной сточной воды. Культивирование на жидкой среде Чапека проводили при температуре 28 °С в стационарной культуре и на качалке при 190 об/мин; на жидкой среде СРYGG – при температуре 22–25 °С в стационарной культуре и на качалке при 300 об/мин. Рост накопительной микробной культуры устанавливали визуально по помутнению среды и микроскопированием фиксированных и окрашенных по Граму препаратов, количественный состав оценивали методом высева на плотные питательные среды [4, 5]. Выделение и получение чистых культур бактерий из накопительных микробных культур осуществляли методом Коха с предварительным последовательным разведением на плотных средах Чапека и CPYGG. Посев осуществляли через 3, 10, 14, 21 суток экспозиции накопительных микробных культур. Микроорганизмы из промышленных сточных вод производства стекловолокна выделяли методом Коха [6] с использованием поверхностного и глубинного культивирования на следующих питательных твердых средах: мясопептонный агар и агаризованная среда М9 [7] следующего состава, г/л: Na2HPO4 – 6,0; KH2PO4 – 3,0; NaCl – 0,5; NH4Cl – 1,0; pH 7,0–7,2. Для выделения специфичной микрофлоры использовали МПА и М9, в которые вносили полиакриламид в количестве 1 г/л. Посевы проводили с использованием метода предельных разведений. Культивирование на среде МПА проводили при температуре 25 °С в течение недели; на среде М9 – в течение 3–4 недель, при температуре 25 °С. Чистые культуры доминирующих бактерий, выросших на чашках Петри, выделяли по методу Коха из отдельных колоний. Чистоту выделенных культур оценивали визуально и микроскопированием препаратов окрашенных фиксированных клеток [8]. При изучении культуральных свойств выделенных штаммов отмечали: форму, профиль колоний, размеры, поверхность, оптические свойства поверхности, цвет, консистенцию. Морфологические свойства изучали микроскопированием фиксированных окрашенных препаратов. К морфологическим признакам относили форму бактерий, размеры клеток, способность к спорообразованию и расположение спор, окраску по Граму [4]. Для изучения физиолого-биохимических свойств определяли потребность бактериальных штаммов в различных источниках углерода, азота, фосфора, амилолитическую, протеолитическую, липолитическую, фунгицидную, эмульгирующую активность, фитотоксичность, способность усваивать основные компоненты сточных вод [5, 9]. Видовую идентификацию бактериальных штаммов проводили путем секвинирования фрагментов гена 16S рРНК в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (ИЭГМ УрО РАН). Способность микроорганизмов деградировать ПАВ изучали флуориметрическим методом, который основан на экстракции хлороформом ионных пар АПАВ (додецилсульфата натрия) с красителем акридиновый желтый, деградации КПАВ (цетилпиридиний хлористого) – на экстракции хлороформом ионных пар КПАВ с красителем эозин и измерении концентрации ПАВ в полученном экстракте с помощью анализатора жидкости «Флюорат-02» [10, 11]. Результаты исследований и их обсуждение При постановке накопительных микробных культур нефтешламов и замазученных сточных вод и при прямом посеве проб сточных вод производства стекловолокна в чистые культуры при последовательных пересевах выделены бактериальные изоляты: 31 из нефтешламов, 25 – замазученных сточных вод, 8 – сточных вод (табл. 1). При изучении культурально-морфологических свойств бактерий установлено, что они представлены грамположительными и грамотрицательными формами. Изучение физиолого-биохимических свойств показало, что все изоляты способны усваивать углерод, азот и фосфор как основные источники энергии в органической и минеральной форме, обладают протеолитической, липолитической, эмульгирующей и фунгицидной активностью, способны усваивать основные компоненты сточных вод. Первичный скрининг среди выделенных изолятов позволил отобрать 13 культур, обладающих максимальными показателями по активности роста на средах с различными источниками углерода, высокой эмульгирующей активности, способности усваивать ПАВ в качестве источников питания. Таблица 1 Список чистых культур микроорганизмов Объект, из которого выделена культураИдентификация культуры Сточные воды очистных сооружений АООТ «Астраханское стекловолокно»Kocuria rosea Kocuria polustris Pseudomonas seleniipraecipitans Proteus vulgaris Staphylococcus warneri А Нефтешламы очистных сооружений Астраханского газоперерабатывающего заводаStaphylococcus warneri Т Stenotrophomonas maltophilia Bacillus safensis Bacillus tequilensis Продолжение табл. 1 Объект, из которого выделена культураИдентификация культуры Замазученные сточные воды нефтебазыBacillus amyloliquefaciens Bacillus licheniformis Bacillus anthracis Bacillus vallismortis Для изучения способности бактериальных культур к деградации ПАВ использовали модельные растворы с концентрациями анионных (додецилсульфат натрия) и катионных (цитилпиридиний хлористый) ПАВ 1, 2, 10 и 20 мг/дм3. Титр клеток бактериальных штаммов при внесении составлял 103–104 КОЕ/мл. В результате исследований установлено, что все штаммы обладают способностью к деградации как анионных, так и катионных ПАВ (табл. 2). При этом деградация катионных ПАВ происходит несколько медленнее. Таблица 2 Деградация ПАВ бактериальными штаммами в модельных растворах, % Время эксперимента (сутки)КонтрольKocuria roseaKocuria polustrisPseudomonas seleniipraecipitansProteus vulgarisStaphylococcus warneri А.Staphylococcus warneri Т.Stenotrophomonas maltophiliaBacillus safensisBacillus tequilensisBacillus amyloliquefaciensBacillus licheniformisBacillus anthracisBacillus vallismortis АПАВ 1 мг/дм3 24779,88892,292,196,192,590,782,484,685,781,183,681,7 35590,29394,896,410095,193,284,186,489,583,787,387,5 464100100100100–96,295,395,592,597,485,497,190,2 АПАВ 2 мг/дм3 233,897,399,197,180,598,876,983,093,890,792,390,693,189,3 3519910098,396,210083,889,794,692,493,891,294,791,2 463100–100100–88,392,795,493,594,993,295,292,3 АПАВ 10 мг/дм3 452,899,399,499,399,899,394,697,696,599,197,998,699,594,3 558,510010010010010098,698,597,997,794,497,999,298,2 668,1–––––96,396,097,998,898,498,898,398,4 АПАВ 20 мг/дм3 426,399,799,799,799,799,872,695,494,697,695,495,985,897,3 52910010010010010085,498,897,494,596,799,999,997,8 631,5–––––92,399,398,597,498,693,999,999,1 КПАВ 1 мг/дм3 3138791866091,526,795,134,360,249,368,683,749,2 4209494,694989794,810045,272,663,873,385,276,9 523100100100100100100-94,780,282,791,387,991,1 626–––––––97,590,296,592,791,294,6 КПАВ 2 мг/дм3 424,59098,79499,47472,156,883,778,873,278,957,184,8 53910010097,51009676,762,688,393,175,193,183,988,5 655––н/о*–н/о92,272,393,893,483,19491,594,9 КПАВ 10 мг/дм3 51899,299,599,299,699,390,080,488,770,373,178,378,559,9 622,8н/он/он/он/он/о9486,887,788,185,388,784,892,4 КПАВ 20 мг/дм3 54,59494,695,891,19445,055,464,362,151,556,463,661,9 67,5н/он/он/он/он/о63,160,473,665,252,360,784,863,9 * н/о – не определялось. При минимальных концентрациях АПАВ (1 и 2 мг/дм3) деградация интенсивно (88,3–100 %) проходит в течение 3–4 суток, при повышенных концентрациях АПАВ (10 и 20 мг/дм3) (рис. 1) – в течение 5–6 суток (92,3–100 %). Рис. 1. Деградация АПАВ бактериальными штаммами В отношении КПАВ все выделенные штаммы также проявили высокую эффективность, хотя процесс деградации проходит неоднозначно (рис. 2). Так, при минимальных концентрациях КПАВ (1 и 2 мг/дм3) деградация интенсивно (72,3–100 %) всеми штаммами бактерий проходит в течение 5–6 суток. При повышенных концентрациях КПАВ в течение 5-ти суток для штаммов, выделенных из сточных вод производства стекловолокна, деградация цитилпиридиния хлористого выше и составляет 99,2–99,5 % при концентрации 10 мг/дм3, 91,1–95,8 % – 20 мг/дм3. Для штаммов, выделенных из нефтешламов и замазученных сточных вод, эти значения несколько ниже (84,8–92,4 % на 5-е сутки и 52,3–84,8 % на 6-е сутки). В целом наиболее эффективными как в отношении анионных, так и катионных ПАВ оказались штаммы Kocuria rosea, Kocuria polustris, Pseudomonas seleniipraecipitans, Proteus vulgaris, Staphylococcus warneri А., выделенные из сточных вод производства стекловолокна, в составе которых ПАВ являются превалирующими загрязнителями. Несмотря на то, что ПАВ оказывают повреждающее действие на микроорганизмы, повышая проницаемость мембраны или разрушая ее, имеющиеся литературные данные показывают, что микроорганизмы могут приобрести резистентность как к катионным, так и к анионным ПАВ [2]. Исследования позволили выделить из нефтешламов и сточных вод микроорганизмы, не только резистентные к токсическому действию ПАВ, но и способные к деградации анионных и катионных ПАВ. Рис. 2. Деградация КПАВ бактериальными штаммами Исследования разложения ПАВ чистыми культурами микроорганизмов [12] показали, что Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Salmonella enteritidis, Paracolobactrum aerogenoides при выращивании на синтетической среде могут использовать различные анионные ПАВ в качестве единственного источника углерода. Из почвы, взятой в районе очистного сооружения, методом накопительных культур выделены 3 штамма Pseudomonas, в том числе Ps. fluorescens, и два штамма Nocardia sp., которые активно разрушали АПАВ [12]. Имеются сведения о способности Ps. putida ТП-19 (В-6582) деградировать неионогенные и анионные ПАВ [7]. Анализ имеющихся литературных данных показывает, что деструкторы ПАВ встречаются чаще среди бактерий – представителей родов Pseudomonas, Bacillus, но в то же время установлено, что способность разрушать ПАВ широко варьирует у микроорганизмов, даже среди представителей одного рода. Исследования деградации ПАВ микробными культурами чаще ограничиваются лабораторными экспериментами, т. к. имеются определенные сложности при внедрении в практику очистки сточных вод. В то же время метод локальной микробной очистки, удельный вес использования которого в настоящее время в отношении ПАВ-содержащих сточных вод сохраняется на уровне 13 % как самостоятельно, так и в комплексе с физико-химическими методами [13], является наиболее перспективным для обезвреживания высококонцентрированных стоков, т. к. единственной группой организмов, вносящей реальный вклад в разрушение ПАВ в окружающей среде, являются бактерии. Этот метод отличается экологической безопасностью, высокой экономичностью и эффективностью по сравнению с другими методами. Полученные в ходе исследования штаммы бактерий показали активность в отношении биодеградации анионных и катионных ПАВ, что представляет интерес для использования их в разработке методов и способов очистки сточных вод.
References

1. Ostroumov S. A. Biologicheskaya aktivnost' vod, soderzhaschih PAV // Himiya i tehnologiya vody. 1991. – T. 13, N 3. – S. 270–282.

2. Stavskaya S. S., Udod V. M., Taranova L. A. Mikrobiologicheskaya ochistka vody ot poverhnostno-aktivnyh veschestv. – Kiev: Nauk. dumka, 1988. – 184 s.

3. Poisk novyh bakterial'nyh ekzopolisaharidov dlya neftegazovogo kompleksa / T. S. Sohan', Danyan' Chzhan, I. V. Botvinko, A. I. Netrusov // Zaschita okruzhayuschey sredy v neftegazovom komplekse. – 2008. – № 5. – S. 62–64.

4. Tepper E. Z., Shil'nikova V. K., Pereverzeva G. I. Praktikum po mikrobiologii / pod red. V. K. Shil'nikovoy. – M.: Drofa, 2004. – 256 s.

5. Praktikum po mikrobiologii / A. I. Netrusov, M. A. Egorova, L. M. Zaharchuk i dr.; pod red. A. I. Netrusova. – M.: Akademiya, 2005. – 608 s.

6. Gradova N. B., Babusenko E. S., Gornova I. B. Laboratornyy praktikum po obschey mikrobiologii. – M.: DeLi print, 2004. – 144 s.

7. Turkovskaya O. V. Biologicheskie i tehnologicheskie aspekty mikrobnoy ochistki stochnyh vod i prirodnyh ob'ektov ot poverhnostno-aktivnyh veschestv i nefteproduktov: dis. … d-ra. biol. nauk. – Saratov, 2000. – 360 s.

8. Rukovodstvo k prakticheskim zanyatiyam po mikrobiologii: prakt. posobie / pod red. N.S. Egorova. – M.: Izd-vo Mosk. un-ta, 1983. – 251 s.

9. Loginov O. N. Bakterii Pseudomonas i Azotobacter kak ob'ekty sel'skohozyaystvennoy biotehnologii) / otv. red. F. M. Shakirova. – M.: Nauka, 2005. – 166 s.

10. PND F 14.1:2:4.158-2000. Metodika vypolneniya izmereniy massovoy koncentracii anionnyh poverhnostno-aktivnyh veschestv (APAV) v probah prirodnoy, pit'evoy i stochnoy vody fluorimetricheskim metodom na analizatore zhidkosti «Flyuorat-02» / Utv. 2000-03-15. – M., 2000. – 21 s.

11. PND F 14.1:2:4.39-95. Metodika vypolneniya izmereniy massovoy koncentracii kationnyh poverhnostno-aktivnyh veschestv (KPAV) v probah prirodnoy, pit'evoy i stochnoy vody na analizatore zhidkosti «Flyuorat-02» / Utv. 1995-06-23. – M., 1995. – 17 s.

12. Rotmistrov M. N. Mikrobiologiya ochistki vody / M. N. Rotmistrov, P. I. Gvozdyak, S. S. Stavskaya. – Kiev: Nauk. dumka, 1978. – 268 s.

13. Klimenko H. A., Timoshenko M. N. Fiziko-himicheskie metody ochistki promyshlennyh stochnyh vod ot sinteticheskih poverhnostno-aktivnyh veschestv // Himiya i tehnologiya vody. – 1993. – T. 15, № 7–8. – S. 534–566.


Login or Create
* Forgot password?