MONITORING OF ANTIBIOTIC RESISTANCE OF ENTEROBACTERIA, ISOLATED FROM ZANDER (STIZOSTEDION LUCIOPERCA L.) AND WATER IN ITS HABITAT
Abstract and keywords
Abstract (English):
The results of the study of antibiotic resistance of Enterobacteriaceae isolated from water of the Volga River delta and the gills, liver, colon zander are presented. 355 representatives of zander and 300 samples of water are analyzed. As a result, there have been tested 1296 strains of Enterobacteriaceae isolated from water and fish. Antibiotic resistance of bacteria was determined by standard methods of agar disk diffusion with benzyl penicillin, ampicillin, cefazolin, erythromycin, furadonin, tetracycline, chloramphenicol and tobramycin. Strains resistant to four or more antibiotics are considered to be polyresistant. Comparative data on their sensitivity to the test antibiotics are given. It is stated that all the studied organisms have multiple antibiotic resistance, depending on the season and habitable biotope. Water strains of Enterobacteriaceae of Belinsky and the main bank were resistant to the used antibiotics in 57.6 ± 0.4 and 45.4 ± 0.8 % of cases, respectively. Significant differences in the strains isolated from fish in these areas have not been established. Average minimum sensitivity of water strains to benzyl penicillin was 3.9 ± 0.9; fish strains – 3.6 ± 0.7 % of samples. Average maximum sensitivity of aquatic strains to chloramphenicol and tobramycin was 8.2 ± 1.0 and 11.2 ± 0.9 % of samples, respectively. A similar sensitivity of fish strains to chloramphenicol and tobramycin was 8.4 ± 0.9 and 10.6 ± 0.8 % of samples. Minimum antibiotic resistance of Enterobacteriaceae was registered to tobramycin and chloramphenicol in water and gills, the maximum to benzyl penicillin and ampicillin in the intestines of fish. The obtained data can be used as markers of sanitary-epidemiological and ecological problems of freshwater hydro-ecosystem.

Keywords:
enterоbacteria, antibiotics, resistance, water, fish, liver, gills, intestines, seasonal dynamics
Text
Publication text (PDF): Read Download

Антибиотикорезистентность условно-патогенной микрофлоры обусловлена высокой пластичностью к постоянно меняющимся условиям ее существования, особенно при многофакторном антропогенном прессе на гидроэкосистемы. Анализ литературных данных показал, что бактерии сем. Enterobacteriaceae, циркулирующие в этой экосистеме, обладают значительным потенциалом персистенции и постоянно пополняют список возбудителей инфекционных заболеваний людей [1]. Кроме того, в настоящее время, вследствие широкого использования антибиотиков в медицине, ветеринарии, аквакультуре, в окружающей среде циркулируют микроорганизмы, устойчивые к химиопрепаратам. Процесс распространения антибиотикорезистентности бактерий является масштабным и нарастающим, что связано с природно-климатическими и антропогенными факторами, особенно в экологически неблагоприятных районах [2–5]. В связи с этим изучение антибиотикорезистентности энтеробактерий в дельте р. Волги и повсеместно обитающего в ней судака (Stizostedion lucioperca L.) является актуальной проблемой региона и может быть использовано в качестве маркеров санитарно-эпидемиологического неблагополучия водной среды и населяющих ее гидробионтов с целью осуществления контроля за качеством объектов окружающей среды. Материал и методы исследований Сбор материала проведен в дельте р. Волги с 1999 по 2010 г. в районах Главного и Белинских банков от 355 экз. судака, а также 300 проб воды в местах его обитания. У рыб исследовали жабры, печень и содержимое кишечника. Отбор проб осуществляли посезонно (май, август, октябрь). Всего протестировано 1 296 штаммов бактерий сем. Enterobacteriaceae, выделенных из воды и рыбы, монотипность которых контролировали путем микроскопирования окрашенных по Граму мазков. Антибиотикорезистентность микроорганизмов определяли в соответствии с общепринятыми методами диффузии на агар дисков с бензилпенициллином, ампициллином, цефазолином, эритромицином, стрептомицином, фурадонином, тетрациклином, левомицетином и тобромицином [6]. Бумажные диски с антибиотиками располагали на одинаковом расстоянии друг от друга и от края чашки. На одну стандартную чашку с мясопептонным агаром (МПА) вносили одновременно не более 5 дисков. Посевы инкубировали в термостате при оптимальной температуре в течение 2 суток. Для получения достоверных результатов, исключающих возможные ошибки, работу выполняли в трех повторностях. Особое внимание уделяли диаметру зоны угнетения роста бактерий на МПА в миллиметрах. Для сравнения устойчивости штаммов использовали количества антибиотиков, к которым штамм резистентен, к числу всех испытанных антибиотиков, выраженных в процентах. Полирезистентными считали штаммы, устойчивые к 4 и более антибиотикам. Статистическую обработку материалов проводили с использованием стандартов параметрического и непараметрического критериев, а также пакета компьютерного программирования StatisticaforWindows. Значимые различия при p < 0,05. Результаты исследований Результаты многолетних мониторинговых исследований показали, что в микробиоценозе гидроэкосистемы дельты р. Волги доминировали представители сем. Enterobacteriaceae. От всей выделенной микрофлоры энтеробактерии составляли в воде и рыбе 28,9 ± 0,47 и 30,6 ± 0,8 % проб соответственно. Ранее эти показатели были выше в 1,2–1,7 раза [7–9], что было статистически достоверно (p < 0,05). По-видимому, это обусловлено абиотическими компонентами гидроэкосистемы, в частности ее маловодностью и повышенными значениями температуры в последние годы, а также влиянием на дельту стоков городских водоемов, значительно инцифицированных бактериями этого семейства [10]. Интенсивный процесс урбанизации обусловил целый ряд экологических проблем, связанных с резким ухудшением качества вод аквальных комплексов как городской среды, так и устьевой области р. Волги [11–13]. В структуре этого семейства доминировали представители р. Citrobacter, составляя в воде и рыбе 24,8 ± 0,5 и 28,4 ± 0,8 % и р. Proteus – в воде и рыбе – 32,7 ± 0,3 и 36,6 ± 0,2 % соответственно. На долю энтеробактеров приходилось 20,0 ± 0,5 (вода) и 22,4 ± 0,8 % (рыба) проб. Санитарно значимые Escherichiacoli и Salmonella sp. в воде и рыбе были зарегистрированы в среднем в 4,8 ± 0,2 и 3,6 ± 0,6 % случаев, что свидетельствует о продолжающемся антропогенном прессинге на исследуемую гидроэкосистему, где условно-патогенные бактерии превалировали над индикаторной. Результаты анализа показали, что все исследуемые энтеробактерии, выявленные в воде и рыбе, проявляли минимальную устойчивость к тобролицину и левомицетину, а максимальную – к бензилпенициллину и ампициллину во все сезоны года. У большинства водных бактерий антибиотикорезистентность была в 1,2–1,6 раза выше, чем у рыбных, за исключением фурадонина, стрептомицина и тетрациклина (рис. 1). а б Рис. 1. Сезонная динамика антибиотикорезистентности исследуемых микроорганизмов: а – вода; б – рыба: 1 – бензилпенициллин; 2 – ампициллин; 3 – цефазолин; 4 – эритромицин; 5 – фурадонин; 6 – стрептомицин; 7 – тетрациклин; 8 – левомицетин; 9 – тобромицин Сравнение фактического материала, собранного посезонно, позволило выявить определенные различия в устойчивости исследуемых энтеробактерий к испытуемым препаратам. У всех штаммов с высокой статистической достоверностью (p < 0,05) она была максимальной в мае, в период паводка, динамично снижаясь к октябрю. В среднем показатели антибиотикоустойчивости «водных» штаммов снизились от весны к осени в 2,7, а «рыбных» – в 1,9 раза. Следовательно, этот фактор персистенции обусловлен средой обитания микроорганизмов (рис. 1). В пользу этого свидетельствуют фактические материалы, приведенные на рис. 2. а б Рис. 2. Сезонная динамика антибиотикорезистентности тестируемых энтеробактерий по зонам угнетения роста на МПА: а – вода; б – рыба Они показывают, что средние показатели зоны угнетения роста бактерий на МПА с антибиотиками как «водных», так и «рыбных» штаммов возрастали в 2,0 и 1,6 раза соответственно, от весны к осени. При этом все штаммы при контакте с цефазолином, левомицетином и тобромицином образовывали всегда максимальные зоны деполиремизации на МПА во все анализируемые сезоны года со стабильными показателями, которые у других препаратов были весьма вариабельны. По-видимому, это связано с повышением в паводковых водах и, следовательно, в рыбе антибиотикорезистентных штаммов бактерий, попавших в гидроэкосистему с различных сельскохозяйственных предприятий, в том числе животноводческих, птицеводческих, а также с продуктами жизнедеятельности урбоэкосистем. Аналогичная тенденция по устойчивости микрофлоры к антибактериальным препаратам была отмечена в городских водотоках г. Астрахани [10]. Авторами было установлено, что уровень антибиотикорезистентности микрофлоры выше всегда весной в тех водоемах, которые испытывают большую техногенную нагрузку и впадают в район Белинского банка. Данные более ранних исследований свидетельствуют о более высокой микробной контаминации воды и рыбы именно в этом районе дельты Волги [7, 9]. Следует отметить, что гидромикрофлора Белинского и Главного банков была устойчива к антибактериальным препаратам в 57,6 ± 0,4 и 45,4 ± 0,8 % случаев соответственно. Существенных различий в антибиотикорезистентности энтеробактерий, выделенных от судака в этих районах дельты Волги, нами не установлено. Мощное антропогенное влияние речного стока на гидроэкосистему Северного Каспия обусловило множественную антибиотикорезистентность микрофлоры на всей ее акватории, причем выделенной как из воды, так и из рыбы: осетровых, бычковых [14]. Особого внимания заслуживают данные, полученные при анализе антибиотикорезистентности энтеробактерий, персистирующих в некоторых органах судака. Это пелагический хищник, имеющий наиболее дегестивный контакт с водной средой, поэтому его микрофлора близко коррелирует с водным бактериоценозом [8]. В этой связи весьма вероятна миграция бактерий по трофическим цепям: фито – зоопланктон – рыбы, которыми питается судак, что согласуется с литературными данными [15]. Известно, что автохтонная кишечная микрофлора необходима для нормального роста и развития рыб, синтезируя до 13 свободных аминокислот, продуцируя витамины и антибиотики. В значительной степени кишечный бактериоценоз определен ферментативной активностью трофических партнеров – микроорганизмов в зависимости от типа и времени обитания рыб [16, 17]. Установлено, что микрофлора жаберной ткани однозначно повторяет водный пейзаж микрофлоры [7, 8, 14]. Данных о роли микрофлоры печени рыб и ее персистентных свойствах в отношении антибиотиков в доступной нам литературе нами не найдено. В связи с этим нами впервые сделана попытка провести детальный анализ устойчивости к антибиотикам энтеробактерий, обсеменяющих воду и некоторые органы судака. Результаты исследований представлены на рис. 3. Они показали, что популяция этих микроорганизмов была представлена штаммами, неоднородными по отношению к лекарственным препаратам. Анализ материала позволил выявить общую тенденцию устойчивого снижения резистентности штаммов из всех анализируемых биотопов от весны к осени в 1,5 раза, что было статистически достоверно (p < 0,05). В целом антибиотикорезистентность «водных» штаммов по сравнению с «кишечными» была выше в 1,7; 1,3 и 1,2 раза в мае, августе и октябре, что, вероятно, связано с депрессией автохтонных бактерий кишечника и повышением активности в этом биотопе аллохтонной микрофлоры, обладающих определенным потенциалом антибиотикорезистентности (рис. 3). В биопрофиле «водных» и «жаберных» штаммов зарегистрированы самые близкие показатели их устойчивости к лекарственным препаратам, за редким исключением – к фурадонину и стрептомицину летом и осенью, т. е. в этих экологических нишах отмечены высокорезистентные штаммы. Напротив, существенные различия в устойчивости к антибиотикам, особенно к левомицетину, показали штаммы бактерий, выделенные из воды и кишечника (рис. 3). Так, доля чувствительных штаммов к этому препарату у кишечной микрофлоры была в 3,0; 3,5 и 2,9 раза ниже, чем у водной в мае, августе и сентябре соответственно. Во всех случаях левомицетин оказывал максимальное ингибирующее воздействие на кишечную популяцию бактерий во все исследуемые сезоны года. По отношению к тобромицину эти различия не носили значимого характера. Исключение было отмечено в августе, когда устойчивость кишечной микрофлоры к этому препарату была выше, чем у водной в 1,7 раза (p < 0,05). Август – это время интенсивного питания судака, оно совпадает с максимальным уровнем ферментативности его кишечной микрофлоры, которая в сотни раз выше, чем зимой. Существенными были различия в антибиотикорезистентности к стрептомицину, фурадонину, эритромицину и тетрациклину только осенью, когда кишечная микрофлора была устойчивее «водной» в 3,1; 2,6 и 1,7 раза (p < 0,05). Такая тенденция, вероятно, связана с миграцией энтеробактерий по трофическим цепям различных водных аквабиот, поскольку судак в это время еще активно питается. а б Рис. 3. Сезонная динамика антибиотикорезистентности исследуемых микроорганизмов в воде и рыбе: а – май; б – август: 1 – бензилпенициллин; 2 – ампициллин; 3 – цефазолин; 4 – эритромицин; 5 – фурадонин; 6 – стрептомицин; 7 – тетрациклин; 8 – левомицетин; 9 – тобромицин в Рис. 3. Сезонная динамика антибиотикорезистентности исследуемых микроорганизмов в воде и рыбе: в – октябрь: 1 – бензилпенициллин; 2 – ампициллин; 3 – цефазолин; 4 – эритромицин; 5 – фурадонин; 6 – стрептомицин; 7 – тетрациклин; 8 – левомицетин; 9 – тобромицин Очевидно, это обусловило сложные симбиотические взаимоотношения аллохтонной и автохтонной микрофлоры кишечника, являющейся эволюционно закрепленной формой ее существования. Между тем в кишечнике рыб функционирует собственная иммунная система, представленная мощным лейкоцитарным слоем в слизистой оболочке и пейеровыми бляшками, содержащими В-, М- и Т-клетки. Кроме того, существенна роль автохтонной микрофлоры в синтезе антибиотических веществ, подавляющих рост аллохтонной патогенной микрофлоры [16, 17]. Функциональными особенностями иммунной системы волжского судака являются хорошо развитые клеточные механизмы неспецифической резистентности – активность нейтрофилов в лизосомальном – катионовом тесте и фагоцитозе, а также невысокий показатель повреждения нейтрофилов [18]. Кроме того, у рыб лизоцим и комплимент занимают важное место среди агентов, обладающих антибактериальным действием. Они представлены системой низкомолекулярных белков, вызывающих лизис микроорганизмов путем гидролиза нерастворимых полисахаридов клеточных оболочек. Обнаружены в слизи кожи, жабр, стенках кишечника и желчных кислотах печени с максимальной активностью осенью. Предполагают, что некоторые рыбы имеют иммуноглобулины [19, 20]. В связи с этим печень принимает активное участие в иммунных реакциях не только осуществляя детоксикацию организма рыб, но и выполняя роль противомикробной защиты. Поэтому можно предположить, что этот орган, имея потенциал противомикробной защиты, обеспечивает динамичное снижение микроорганизмов, устойчивых к антибактериальным препаратам. В пользу этого свидетельствуют данные рис. 3. Они показывают, что уровень антибиотикорезистентных штаммов исследуемых микроорганизмов был в среднем в 1,1–1,3 раза выше в печени по сравнению с теми же показателями кишечной микрофлоры и ниже в 1,1–1,5 раза «водных» штаммов. Исключение отмечено только в отношении левомицетина, устойчивость к которому была у микроорганизмов, изолированных из печени, в среднем в 2,6 раза выше, чем у кишечной микрофлоры, а осенью она увеличилась в 3,1 раза. Можно предположить, что печень судака, наряду с кишечником, играет существенную роль в элиминировании энтеробактерий, при этом снижая их антибиотикорезистентность. Полученные данные по антибиоткорезистентности микрофлоры судака и воды в местах его обитания могут быть использованы в качестве индикаторов санитарно-эпидемиологического и экологического неблагополучия гидроэкосистемы. Заключение Таким образом, анализ многолетнего материала свидетельствует о значительном персистировании в воде и рыбе антибиотикорезистентной микрофлоры сем. Enterobacteriaceae. Полирезистентными оказались 51,5 ± 0,4 % штаммов, выделенных из воды, и 47,7 ± 0,7 %, изолированных из рыбы. Минимальная устойчивость всех испытуемых микроорганизмов отмечена к тобромицину и левомицетину, а максимальная – к бензилпенициллину и ампициллину. Показатели устойчивости к антибактериальным препаратам у водных штаммов были в 1,2–1,4 раза выше, чем у рыбных во все сезоны наблюдений с динамичным снижением от весны к осени в 2,7 раза у водных и в 1,9 раза – у рыбных штаммов. При этом отмечена тенденция роста зоны угнетения на МПА со всеми испытуемыми препаратами и штаммами бактерий от весны к осени. Иммунная система, по литературным данным [19, 20], функционирующая в кишечнике и печени рыб, по-видимому, обусловила снижение доли антибиотикорезистентных штаммов в этих органах. Они были значительно ниже аналогичных показателей у «водных» штаммов. Максимальная антибиотикорезистентность всех тестируемых рыбных штаммов была зарегистрирована весной, во время паводка, а минимальная – осенью, во время интенсивного питания этого вида рыб, что обусловлено сложными симбиотическими взаимоотношениями аллохтонной антибиоткорезистентной и автохтонной микрофлорой рыбы, способной также продуцировать свои антибиотики. Следовательно, этот персистентный признак может быть различным в разных экологических нишах, т. к. в значительной степени он зависит не только от абиотических, но и биотических факторов, экологических особенностей симбионтов жертвы и пищевых цепей.
References

1. Zhuravlev P. V., Aleshnya V. V., Golovina S. V. Monitoring bakterial'nogo zagryazneniya vodoemov Rostovskoy oblasti // Gigiena i sanitariya. - 2010. - № 5. - S. 33-36.

2. Antibiotikorezistentnost' bakteriy mikrobiocenozov vodnyh ob'ektov kak pokazatel' antropogennoy nagruzki na vodoem (na primere r. Leny) / E. V. Anganova, A. D. Kurnosov, I. Yu. Samoylova, E. D. Savilov // Sibirskiy medicinskiy zhurnal. - 2008. - № 1. - S. 75-76.

3. Kal'nickaya O. I., Usha B. V., Mishiev E. A. Veterinarno-sanitarnaya ocenka produktov zhivotnogo proishozhdeniya, soderzhaschih antibiotiki // Veterinariya. - 2010. - № 2. - S. 61-63.

4. Lemke M. J., Leff L. G. Bacterial population in an anthropogenically disturbed stream: comparison of differed seasons // Microb. Ecol. - 1999. - Vol. 38. - P. 234-243.

5. Rossolini G. M., Manteugoli E. Antimicrobial resistance in Europe and its potential impact on empirical therapy // Clin. Microbiol. and Infec. - 2008. - Vol. 14. - P. 33-41.

6. Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam: metod. ukaz. - M.: Feder. centr Gossanepidnadzora Minzdrava Rossii, 2004.

7. Larceva L. V. Gigienicheskaya ocenka po mikrobiologicheskim pokazatelyam ryby i rybnyh produktov Volgo-Kaspiyskogo regiona: avtoref. dis. … d-ra biol. nauk. - M., 1998. - 44 s.

8. Obuhova O. V. Bakteriocenoz vody i sudaka (Stizostedion lucioperca) v del'te Volgi: avtoref. dis. … kand. biol. nauk. - M., 2004. - 24 s.

9. Obuhova O. V., Larceva L. V., Lisickaya I. A. Sanitarno-mikrobiologicheskaya ocenka gidroekosistemy del'ty Volgi // Gigiena i sanitariya. - 2009. - № 1. - S. 23-25.

10. Larceva L. V., Istelyueva A. A. Geoekologicheskie osobennosti antibiotikorezistentnosti mikroflory vnutrennih vodotokov g. Astrahani // Geologiya, geografiya i global'naya energiya. - 2011. - № 3 (42). - S. 180-186.

11. Beschetnova E. I., Katunin D. N., Galushkina N. V. Izmeneniya himicheskih osnov formirovaniya bioproduktivnosti Volgo-Kaspiya posle zaregulirovaniya volzhskogo stoka // Vodnye resursy Volgi: nastoyaschee i buduschee, problemy upravleniya: materialy Vseros. nauch.-prakt. konf., 3-5 oktyabrya 2007 g. - Astrahan': Izd. dom «Astrahanskiy universitet», 2007. - S. 35-37.

12. Zhizhimova G. V. Gidrobiologicheskiy monitoring ekologicheskogo sostoyaniya vnutrennih vodoemov g. Astrahani: avtoref. dis. … kand. biol. nauk. - Astrahan', 2009. - 24 s.

13. Kuzin A. V. Formirovanie biotopov ust'evoy oblasti Volgi pod vliyaniem prirodnyh faktorov i hozyaystvennoy deyatel'nosti: avtoref. dis. … kand. geogr. nauk. - Astrahan', 2009. - 24 s.

14. Lisickaya I. A. Bakterial'nye soobschestva nekotoryh komponentov ekosistemy del'ty Volgi i Severnogo Kaspi: avtoref. dis. … kand. biol. nauk. - Astrahan', 2008. - 23 s.

15. Litvin V. Yu., Pushkareva V. I. Faktory patogennosti bakteriy: funkcii v okruzhayuschey srede // Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii. - 1994. - XII-IX. - S. 83-87.

16. Ugolev A. M., Kuz'mina V. V. Pischevaritel'nye processy i adaptaciya u ryb. - SPb.: Gidrometeoizdat, 1993. - 238 s.

17. Tannock G. W. Analysis of the intestinal microflora: a renaissance // Antonie van Leeuwenhoek. - 1999. - Vol. 76. - P. 265-278.

18. Valedskaya O. M. Sravnitel'naya ocenka nekotoryh bar'ernyh sistem volzhskogo sudaka v norme i pri dermatofibrosarkome: avtoref. dis. … kand. biol. nauk. - Astrahan', 1996. - 17 s.

19. Zabotkina E. A., Lapirova T. B., Mikryakov V. R. Metody ocenki immunologicheskogo statusa presnovodnyh kostistyh ryb // Rasshirennye materialy Vseros. nauch.-prakt. konf. «Epizootologicheskiy monitoring v akvakul'ture: sostoyanie i perspektivy». - M., 2005. - S. 40-44.

20. Ihtiopatologiya / N. A. Golovina, Yu. A. Strelkov, V. N. Voronin, P. P. Golovin, E. B. Evdokimova, L. N. Yuhimenko. - M.: Kolos, 2010. - 512 s.


Login or Create
* Forgot password?