THE USE OF GLYCEROL FOR THE CRYOPRESERVATION OF INCONNU’S SPERM
Authors:
1.
Astrakhan State Technical University
2.
Astrakhan State Technical University
(Candidate of Biology; Leading Researcher of the Research Laboratory of Biotechnologies of Conservation and Reproduction of Valuable Fish Species)
Type:
Article
Pages:
from 117
to 121
Status:
Published
Received:
05.06.2017
Accepted:
25.06.2017
Published:
25.06.2017
Subject area:
UDK 575.17
GRNTI 34.39 Физиология человека и животных
GRNTI 62.13 Биотехнологические процессы и аппараты
GRNTI 69.01 Общие вопросы рыбного хозяйства
GRNTI 69.25 Аквакультура. Рыбоводство
GRNTI 69.31 Промышленное рыболовство
GRNTI 69.51 Технология переработки сырья водного происхождения
GRNTI 87.19 Загрязнение и охрана вод суши, морей и океанов
GRNTI 34.39 Физиология человека и животных
GRNTI 62.13 Биотехнологические процессы и аппараты
GRNTI 69.01 Общие вопросы рыбного хозяйства
GRNTI 69.25 Аквакультура. Рыбоводство
GRNTI 69.31 Промышленное рыболовство
GRNTI 69.51 Технология переработки сырья водного происхождения
GRNTI 87.19 Загрязнение и охрана вод суши, морей и океанов
Language:
Russian
Keywords:
cryopreservation, glycerol cryoprotectant, sperm, inconnu, freezing, thawing
Abstract (English):
The article studies the possibility to use glycerol as cryoprotectant, instead of dimethylsulfoxide for cryopreservation of sperm of inconnu ( Stenodus leucichthys Gueldenstaedtii, 1772). Investigations were carried out from 2015 to 2016 in the laboratory of the Southern Scientific Center, Russian Academy of Sciences, on the basis of the Astrakhan State Technical University. The material collected on the Alexander sturgeon hatcheries (the Astrakhan region) in the spawning period. Native sperm of 6 male inconnu species was used as a control means. The semen quality was determined in terms of moving activity (life time) of sperm after its activation by water. As the cryoprotectant there were used: base solution - 80%, sucrose - 1.71 g/l, mannite - 0.98 g/l, yolk - 10%, dimethylsulfoxide - 10% and base solution - 87%, sucrose - 1.71% g/l, mannite - 0.98 g/l, yolk - 10%, glycerol - 3 variants: 3; 5 and 10%. In order to provide the most complete penetration of cryoprotectants into the cells there were used electrostimulation of cell membranes. Equilibration time was 5 and 15 minutes. Thawing semen was performed in a water bath at a temperature of 38-40°C. For removing protectors from cells there was chosen a saline solution (0.7% NaCl) as isotonic solution. In tests using dimethylsulfoxide life activity of sex cells was 2 times lower than in tests with glycerol: 78 and 186.2 s at the end of equilibration and 52.3 and 128.9 s after thawing. Sperm showed maximum activity under 5% glycerol concentration during equilibration - 15 min. Concentration of 3% was insufficient, concentration of 10% was excessive, as it suppressed activity of sperm. Egg yolk which coagulated together with glycerol, making difficulty for observing, had to be excluded from the composition of cryoprotectant.
The article studies the possibility to use glycerol as cryoprotectant, instead of dimethylsulfoxide for cryopreservation of sperm of inconnu ( Stenodus leucichthys Gueldenstaedtii, 1772). Investigations were carried out from 2015 to 2016 in the laboratory of the Southern Scientific Center, Russian Academy of Sciences, on the basis of the Astrakhan State Technical University. The material collected on the Alexander sturgeon hatcheries (the Astrakhan region) in the spawning period. Native sperm of 6 male inconnu species was used as a control means. The semen quality was determined in terms of moving activity (life time) of sperm after its activation by water. As the cryoprotectant there were used: base solution - 80%, sucrose - 1.71 g/l, mannite - 0.98 g/l, yolk - 10%, dimethylsulfoxide - 10% and base solution - 87%, sucrose - 1.71% g/l, mannite - 0.98 g/l, yolk - 10%, glycerol - 3 variants: 3; 5 and 10%. In order to provide the most complete penetration of cryoprotectants into the cells there were used electrostimulation of cell membranes. Equilibration time was 5 and 15 minutes. Thawing semen was performed in a water bath at a temperature of 38-40°C. For removing protectors from cells there was chosen a saline solution (0.7% NaCl) as isotonic solution. In tests using dimethylsulfoxide life activity of sex cells was 2 times lower than in tests with glycerol: 78 and 186.2 s at the end of equilibration and 52.3 and 128.9 s after thawing. Sperm showed maximum activity under 5% glycerol concentration during equilibration - 15 min. Concentration of 3% was insufficient, concentration of 10% was excessive, as it suppressed activity of sperm. Egg yolk which coagulated together with glycerol, making difficulty for observing, had to be excluded from the composition of cryoprotectant.
Keywords:
cryopreservation, glycerol cryoprotectant, sperm, inconnu, freezing, thawing
cryopreservation, glycerol cryoprotectant, sperm, inconnu, freezing, thawing
Введение В настоящее время гидрологические условия, а также нарастающее антропогенное воздействие на водные экосистемы не только оказывают влияние на физиологическое состояние гидробионтов, но и приводят к снижению численности видов. Белорыбицу, например, в Волго-Каспийском бассейне уже можно отнести к исчезающим видам, т. к. сохранение и увеличение ее запасов возможно только при обязательном развитии заводского разведения. Однако эффективность пополнения популяций за счет искусственного воспроизводства снижается из-за резкого уменьшения количества производителей. Использование приемов и методов криобиологии для сохранения жизни на Земле является одним из наиболее перспективных направлений деятельности человека. В основе генотипического принципа лежит фундаментальное научное положение о том, что наследственная информация о главных свойствах и признаках вида хранится в генах, совокупность которых представляет собой генотипы отдельных организмов. Сохранение наследственной информации является еще одной стратегией охраны видов. Генотипический принцип в качестве самостоятельного способа предполагает обеспечение длительного хранения генотипов - создание генетических банков редких и исчезающих видов. Это особенно необходимо там, где исчерпаны все резервы сохранения естественных популяций вида, а также там, где неконтролируемая интродукция и гибридизация ведут к утрате чистых природных популяций, к утрате генофонда. Глубокая заморозка спермиев белорыбицы имеет свои особенности, поэтому корректировка отдельных ее операций является необходимой для внедрения технологии в производственные условия. Криоконсервация остается одним из наиболее привлекательных и быстроразвивающихся направлений сохранения редких исчезающих видов. Наличие в криобанке генетически репрезентативных коллекций геномов рыб и маточных стад на рыбоводных заводах позволит с максимальным эффектом сохранить генетическое разнообразие ценных промысловых объектов. К настоящему времени разработаны методики криоконсервации половых продуктов рыб, в частности осетровых. Однако результаты, полученные с применением этих методик, не всегда можно воспроизвести, и, кроме того, они не всегда обеспечивают высокую выживаемость дефростированных сперматозоидов. Это связано с тем, что на процесс криоконсервации оказывает влияние большое количество факторов: физиологическое состояние производителей, качество половых продуктов, индивидуальные особенности рыб разных популяций, физические факторы и т. д. Криопротекторы являются основным фактором, защищающим клетки от разрушений при низких значениях температурах. Одним из таких традиционных криопротекторов является диметилсульфоксид (ДМСО), успешно используемый при криокосервации проходных видов рыб (осетровые, сиговые). Однако это вещество довольно токсично и не позволяет получать устойчиво высокие результаты при криоконсервации сперматозоидов белорыбицы. Более приемлемым по своим химическим свойствам является глицерин, использование которого при замораживании спермы белорыбицы нам кажется более перспективным. Целью исследования являлось изучение возможности использования в качестве криопротектора глицерина вместо ДМСО для криоконсервации спермы белорыбицы. Материал и методы исследований Исследования проводились в 2015-2016 гг. в лаборатории Южного научного центра РАН на базе Астраханского государственного технического университета. Материал для работы (сперму белорыбицы) получали на Александровском осетровом рыбоводном заводе Севкаспрыбвода (Астраханская обл.) в период нерестовой кампании. При оценке качества спермы учитывали ее консистенцию и цвет. Качество спермы, пригодной для криоконсервации, определяли по времени жизни спермиев после ее активации. На предметное стекло наносили каплю спермы, затем разбавляли ее водой в соотношении 1:200, тем самым активируя сперматозоиды. Двигательную активность спермиев (время жизни) регистрировали на мониторе персонального компьютера с использованием видеоприставки под микроскопом при увеличении от 180 до 400 раз. В качестве криопротектора использовались следующие составы: - базовый раствор - 80 %, сахароза - 1,71 г/л, маннит - 0,98 г/л, яичный желток - 10 %, ДМСО - 10 %; - базовый раствор - 87 %, сахароза - 1,71 г/л, маннит - 0,98 г/л, яичный желток - 10 %, глицерин - 3 варианта: 3; 5 и 10 %. Время эквилибрации 5 и 15 минут. После эквилибрации проверяли степень проникновения криопротектора внутрь клеток путем определения времени их жизни. Пробы спермы замораживали в ампулах Эппендорфа, емкостью 1,5-2 мл при скорости 1 200 об./мин. Образцы хранили в сосудах Дьюара. Размораживание материала осуществляли на водяной бане при температуре 38-40 °С. Для выведения протекторов из клеток в качестве изотонического раствора был выбран физиологический раствор (0,7 %-ный NaCl). Результаты опытов обрабатывали статистически. Различия между действием факторов устанавливали с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты исследований и их обсуждение За период исследований было проведено 162 опыта. В качестве контроля использовали нативную сперму белорыбицы от 6 самцов. Первые серии опытов со спермиями белорыбицы, время эквилибрации в которых составило 5 минут, как с глицерином, так и с ДМСО в качестве протектора для замораживания спермы данного вида рыб после оттаивания, показали отрицательный результат. Поскольку причиной этого является недостаточное время эквилибрации, было решено увеличить время эквилибрации до 15 минут. Результаты исследования приведены в таблице. После эквилибрации с ДМСО наибольшее время жизни спермиев в среднем составило 78 с; после эквилибрации с глицерином - 186 с при концентрации глицерина 5 %. Таким образом, установлены достоверные различия меду действием ДМСО и глицерина после проникновения их в клетки (t-критерий - 25). Результаты криоконсервации спермы белорыбицы ♂№ Контроль, с После эквилибрации После оттаивания ДМСО Глицерин, % ДМСО Глицерин, % 3 5 10 3 5 10 4 87 62 57 97 75 76 46 49 63 88 172 95 100 68 178 62,54 80,42 56,63 66,56 63,51 - - - 111,92 96,91 58,88 5 68 119 68 49 55 61 85 60 69 132 289 199 74 52 64 36,100 40,40 53,37 83,51 80,73 60,127 158,174 211,158 151,132 64,82 52,62 50,42 6 75 69 110 80 90 119 114 79 165 104 352 244 116 54 88 61,56 29,37 46,50 61,70 56,67 69,65 98,128 84,94 78,81 80,60 55,52 90,59 N 9 9 9 9 9 18 18 12 18 ∑ 715 702 730 1 675 794 942 1 104 1 547 1 284 Среднее 79,4 ± 1,56 78 ± 1,55 81,2 ± 2,12 186,2 ± 3,21 88,3 ± 2,11 52,3 ± 0,99 61,3 ± 1,03 128,9 ± 1,89 71,3 ± 1,06 По средним значениям действия глицерина и ДМСО построены графики времени жизни спермиев по окончании эквилибрации (рис. 1) и после оттаивания (рис. 2). На рис. 1 видно, что разные составы протекторов действуют на сперматозоиды по-разному - ДМСО подавляет их активность (время жизни с ДМСО 78 с, в контроле - 79,4 с). Наибольшую активность спермии проявили при действии глицерина в концентрации 5 %. Очевидно, что концентрация глицерина 3 % в составе криопротектора недостаточна, а концентрация 10 % избыточна, т. к. подавляет активность спермиев. Рис. 1. Время активности сперматозоидов после эквилибрации: 1 - ДМСО; 2 - контроль; 3 - глицерин, 3 %; 4 - глицерин, 10 %; 5 - глицерин, 5 % Рис. 2. Время активности сперматозоидов после оттаивания: 1 - контроль; 2 - ДМСО 3 - глицерин, 3 %; 4 - глицерин, 10 %; 5 - глицерин, 5 % Согласно рис. 2, после оттаивания наибольшее время жизни сперматозоидов было достигнуто при концентрации глицерина 5 %, т. е. концентрация глицерина 5 % является оптимальной. В опытах с ДМСО жизнестойкость половых клеток была почти в 2 раза меньше, чем в опытах с глицерином (52,3 и128,9 с), т. е. ДМСО оказывает на сперму белорыбицы токсическое воздействие. Различия при действии ДМСО и глицерина после оттаивания достоверны (t-критерий - 21). В процессе исследования выяснилось, что яичный желток в сочетании с глицерином в составе криопротектора коагулирует и тем самым создает сложности при просмотре. Полагаем, что его целесообразно исключить из состава протектора. Действие яичного желтка можно компенсировать, увеличив концентрацию маннита и сахарозы. Заключение По результатам исследования можно сделать следующие выводы. 1. Глицерин хорошо связывается с водой, благодаря чему имеет большое преимущество перед другими веществами. Глицерин отлично проникает внутрь мембраны клеток и повышает жизнестойкость спермиев белорыбицы по сравнению с диметилсульфоксидом почти в 2 раза. 2. Наибольшее время жизни спермиев белорыбицы установлено при использовании в составе криопротектора глицерина в концентрации 5 %. 3. Состав протектора для использования в целях криоконсервации спермы белорыбицы, использование которого дало наилучший результат: базовый раствор - 87 %, сахароза - 1,71 г/л, маннит - 0,98 г/л, яичный желток - 10 %, глицерин - 5 %. 4. Яичный желток из состава криопротектора необходимо исключить в связи с тем, что в сочетании с глицерином он коагулирует. Действие яичного желтка можно компенсировать, увеличив концентрацию маннита и сахарозы.
1. Karnauhov V. N. Problemy i perspektivy sozdaniya geneticheskih kriobankov dlya celey sohraneniya bioraznoobraziya // Biofizika zhivoy kletki. 1994. T. 6: Kriokonservaciya geneticheskih resursov v probleme sohraneniya bioraznoobraziya. S. 1-7.
2. Pavlov D. S. Podhody k ohrane redkih i ischezayuschih ryb. Puschino: PNC RAN, 1993. 24 s.
3. Dokina O. B., Cvetkova L. I., Pronina N. D., Milenko V. A. Issledovanie kriokonservacii spermy kak metoda sohraneniya i vosstanovleniya genofonda ryb // Problemy estestvennogo i iskusstvennogo vosproizvodstva ryb v morskih i presnovodnyh vodoemah. Rostov n/D: OOO «CVVR». 175 s. URL: http//www.ssc-ras.ru/ru/page802.html.
4. Cvetkova L. I., Savushkina S. I. Metodicheskoe posobie po kriokonservacii spermy karpa, lososevyh i osetrovyh vidov ryb. Metodicheskoe posobie. M.: VNIIPRH, 1997. 11 s.
5. Cvetkova L. I., Karanova M. V. Krioprotektivnyy effekt nizkomolekulyarnyh i vysokomolekulyarnyh antifriznyh glikoproteinov iz krovi treski Gadus morhua // Biofizika zhivoy kletki. 1994. T. 6: Kriokonservaciya geneticheskih resursov v probleme sohraneniya bioraznoobraziya. S. 77-80.
