Антибиотикорезистентность условно-патогенной микрофлоры обусловлена высокой пластичностью к постоянно меняющимся условиям ее существования, особенно при многофакторном антропогенном прессе на гидроэкосистемы. Анализ литературных данных показал, что бактерии сем. Enterobacteriaceae, циркулирующие в этой экосистеме, обладают значительным потенциалом персистенции и постоянно пополняют список возбудителей инфекционных заболеваний людей [1]. Кроме того, в настоящее время, вследствие широкого использования антибиотиков в медицине, ветеринарии, аквакультуре, в окружающей среде циркулируют микроорганизмы, устойчивые к химиопрепаратам. Процесс распространения антибиотикорезистентности бактерий является масштабным и нарастающим, что связано с природно-климатическими и антропогенными факторами, особенно в экологически неблагоприятных районах [2–5]. В связи с этим изучение антибиотикорезистентности энтеробактерий в дельте р. Волги и повсеместно обитающего в ней судака (Stizostedion lucioperca L.) является актуальной проблемой региона и может быть использовано в качестве маркеров санитарно-эпидемиологического неблагополучия водной среды и населяющих ее гидробионтов с целью осуществления контроля за качеством объектов окружающей среды. Материал и методы исследований Сбор материала проведен в дельте р. Волги с 1999 по 2010 г. в районах Главного и Белинских банков от 355 экз. судака, а также 300 проб воды в местах его обитания. У рыб исследовали жабры, печень и содержимое кишечника. Отбор проб осуществляли посезонно (май, август, октябрь). Всего протестировано 1 296 штаммов бактерий сем. Enterobacteriaceae, выделенных из воды и рыбы, монотипность которых контролировали путем микроскопирования окрашенных по Граму мазков. Антибиотикорезистентность микроорганизмов определяли в соответствии с общепринятыми методами диффузии на агар дисков с бензилпенициллином, ампициллином, цефазолином, эритромицином, стрептомицином, фурадонином, тетрациклином, левомицетином и тобромицином [6]. Бумажные диски с антибиотиками располагали на одинаковом расстоянии друг от друга и от края чашки. На одну стандартную чашку с мясопептонным агаром (МПА) вносили одновременно не более 5 дисков. Посевы инкубировали в термостате при оптимальной температуре в течение 2 суток. Для получения достоверных результатов, исключающих возможные ошибки, работу выполняли в трех повторностях. Особое внимание уделяли диаметру зоны угнетения роста бактерий на МПА в миллиметрах. Для сравнения устойчивости штаммов использовали количества антибиотиков, к которым штамм резистентен, к числу всех испытанных антибиотиков, выраженных в процентах. Полирезистентными считали штаммы, устойчивые к 4 и более антибиотикам. Статистическую обработку материалов проводили с использованием стандартов параметрического и непараметрического критериев, а также пакета компьютерного программирования StatisticaforWindows. Значимые различия при p < 0,05. Результаты исследований Результаты многолетних мониторинговых исследований показали, что в микробиоценозе гидроэкосистемы дельты р. Волги доминировали представители сем. Enterobacteriaceae. От всей выделенной микрофлоры энтеробактерии составляли в воде и рыбе 28,9 ± 0,47 и 30,6 ± 0,8 % проб соответственно. Ранее эти показатели были выше в 1,2–1,7 раза [7–9], что было статистически достоверно (p < 0,05). По-видимому, это обусловлено абиотическими компонентами гидроэкосистемы, в частности ее маловодностью и повышенными значениями температуры в последние годы, а также влиянием на дельту стоков городских водоемов, значительно инцифицированных бактериями этого семейства [10]. Интенсивный процесс урбанизации обусловил целый ряд экологических проблем, связанных с резким ухудшением качества вод аквальных комплексов как городской среды, так и устьевой области р. Волги [11–13]. В структуре этого семейства доминировали представители р. Citrobacter, составляя в воде и рыбе 24,8 ± 0,5 и 28,4 ± 0,8 % и р. Proteus – в воде и рыбе – 32,7 ± 0,3 и 36,6 ± 0,2 % соответственно. На долю энтеробактеров приходилось 20,0 ± 0,5 (вода) и 22,4 ± 0,8 % (рыба) проб. Санитарно значимые Escherichiacoli и Salmonella sp. в воде и рыбе были зарегистрированы в среднем в 4,8 ± 0,2 и 3,6 ± 0,6 % случаев, что свидетельствует о продолжающемся антропогенном прессинге на исследуемую гидроэкосистему, где условно-патогенные бактерии превалировали над индикаторной. Результаты анализа показали, что все исследуемые энтеробактерии, выявленные в воде и рыбе, проявляли минимальную устойчивость к тобролицину и левомицетину, а максимальную – к бензилпенициллину и ампициллину во все сезоны года. У большинства водных бактерий антибиотикорезистентность была в 1,2–1,6 раза выше, чем у рыбных, за исключением фурадонина, стрептомицина и тетрациклина (рис. 1). а б Рис. 1. Сезонная динамика антибиотикорезистентности исследуемых микроорганизмов: а – вода; б – рыба: 1 – бензилпенициллин; 2 – ампициллин; 3 – цефазолин; 4 – эритромицин; 5 – фурадонин; 6 – стрептомицин; 7 – тетрациклин; 8 – левомицетин; 9 – тобромицин Сравнение фактического материала, собранного посезонно, позволило выявить определенные различия в устойчивости исследуемых энтеробактерий к испытуемым препаратам. У всех штаммов с высокой статистической достоверностью (p < 0,05) она была максимальной в мае, в период паводка, динамично снижаясь к октябрю. В среднем показатели антибиотикоустойчивости «водных» штаммов снизились от весны к осени в 2,7, а «рыбных» – в 1,9 раза. Следовательно, этот фактор персистенции обусловлен средой обитания микроорганизмов (рис. 1). В пользу этого свидетельствуют фактические материалы, приведенные на рис. 2. а б Рис. 2. Сезонная динамика антибиотикорезистентности тестируемых энтеробактерий по зонам угнетения роста на МПА: а – вода; б – рыба Они показывают, что средние показатели зоны угнетения роста бактерий на МПА с антибиотиками как «водных», так и «рыбных» штаммов возрастали в 2,0 и 1,6 раза соответственно, от весны к осени. При этом все штаммы при контакте с цефазолином, левомицетином и тобромицином образовывали всегда максимальные зоны деполиремизации на МПА во все анализируемые сезоны года со стабильными показателями, которые у других препаратов были весьма вариабельны. По-видимому, это связано с повышением в паводковых водах и, следовательно, в рыбе антибиотикорезистентных штаммов бактерий, попавших в гидроэкосистему с различных сельскохозяйственных предприятий, в том числе животноводческих, птицеводческих, а также с продуктами жизнедеятельности урбоэкосистем. Аналогичная тенденция по устойчивости микрофлоры к антибактериальным препаратам была отмечена в городских водотоках г. Астрахани [10]. Авторами было установлено, что уровень антибиотикорезистентности микрофлоры выше всегда весной в тех водоемах, которые испытывают большую техногенную нагрузку и впадают в район Белинского банка. Данные более ранних исследований свидетельствуют о более высокой микробной контаминации воды и рыбы именно в этом районе дельты Волги [7, 9]. Следует отметить, что гидромикрофлора Белинского и Главного банков была устойчива к антибактериальным препаратам в 57,6 ± 0,4 и 45,4 ± 0,8 % случаев соответственно. Существенных различий в антибиотикорезистентности энтеробактерий, выделенных от судака в этих районах дельты Волги, нами не установлено. Мощное антропогенное влияние речного стока на гидроэкосистему Северного Каспия обусловило множественную антибиотикорезистентность микрофлоры на всей ее акватории, причем выделенной как из воды, так и из рыбы: осетровых, бычковых [14]. Особого внимания заслуживают данные, полученные при анализе антибиотикорезистентности энтеробактерий, персистирующих в некоторых органах судака. Это пелагический хищник, имеющий наиболее дегестивный контакт с водной средой, поэтому его микрофлора близко коррелирует с водным бактериоценозом [8]. В этой связи весьма вероятна миграция бактерий по трофическим цепям: фито – зоопланктон – рыбы, которыми питается судак, что согласуется с литературными данными [15]. Известно, что автохтонная кишечная микрофлора необходима для нормального роста и развития рыб, синтезируя до 13 свободных аминокислот, продуцируя витамины и антибиотики. В значительной степени кишечный бактериоценоз определен ферментативной активностью трофических партнеров – микроорганизмов в зависимости от типа и времени обитания рыб [16, 17]. Установлено, что микрофлора жаберной ткани однозначно повторяет водный пейзаж микрофлоры [7, 8, 14]. Данных о роли микрофлоры печени рыб и ее персистентных свойствах в отношении антибиотиков в доступной нам литературе нами не найдено. В связи с этим нами впервые сделана попытка провести детальный анализ устойчивости к антибиотикам энтеробактерий, обсеменяющих воду и некоторые органы судака. Результаты исследований представлены на рис. 3. Они показали, что популяция этих микроорганизмов была представлена штаммами, неоднородными по отношению к лекарственным препаратам. Анализ материала позволил выявить общую тенденцию устойчивого снижения резистентности штаммов из всех анализируемых биотопов от весны к осени в 1,5 раза, что было статистически достоверно (p < 0,05). В целом антибиотикорезистентность «водных» штаммов по сравнению с «кишечными» была выше в 1,7; 1,3 и 1,2 раза в мае, августе и октябре, что, вероятно, связано с депрессией автохтонных бактерий кишечника и повышением активности в этом биотопе аллохтонной микрофлоры, обладающих определенным потенциалом антибиотикорезистентности (рис. 3). В биопрофиле «водных» и «жаберных» штаммов зарегистрированы самые близкие показатели их устойчивости к лекарственным препаратам, за редким исключением – к фурадонину и стрептомицину летом и осенью, т. е. в этих экологических нишах отмечены высокорезистентные штаммы. Напротив, существенные различия в устойчивости к антибиотикам, особенно к левомицетину, показали штаммы бактерий, выделенные из воды и кишечника (рис. 3). Так, доля чувствительных штаммов к этому препарату у кишечной микрофлоры была в 3,0; 3,5 и 2,9 раза ниже, чем у водной в мае, августе и сентябре соответственно. Во всех случаях левомицетин оказывал максимальное ингибирующее воздействие на кишечную популяцию бактерий во все исследуемые сезоны года. По отношению к тобромицину эти различия не носили значимого характера. Исключение было отмечено в августе, когда устойчивость кишечной микрофлоры к этому препарату была выше, чем у водной в 1,7 раза (p < 0,05). Август – это время интенсивного питания судака, оно совпадает с максимальным уровнем ферментативности его кишечной микрофлоры, которая в сотни раз выше, чем зимой. Существенными были различия в антибиотикорезистентности к стрептомицину, фурадонину, эритромицину и тетрациклину только осенью, когда кишечная микрофлора была устойчивее «водной» в 3,1; 2,6 и 1,7 раза (p < 0,05). Такая тенденция, вероятно, связана с миграцией энтеробактерий по трофическим цепям различных водных аквабиот, поскольку судак в это время еще активно питается. а б Рис. 3. Сезонная динамика антибиотикорезистентности исследуемых микроорганизмов в воде и рыбе: а – май; б – август: 1 – бензилпенициллин; 2 – ампициллин; 3 – цефазолин; 4 – эритромицин; 5 – фурадонин; 6 – стрептомицин; 7 – тетрациклин; 8 – левомицетин; 9 – тобромицин в Рис. 3. Сезонная динамика антибиотикорезистентности исследуемых микроорганизмов в воде и рыбе: в – октябрь: 1 – бензилпенициллин; 2 – ампициллин; 3 – цефазолин; 4 – эритромицин; 5 – фурадонин; 6 – стрептомицин; 7 – тетрациклин; 8 – левомицетин; 9 – тобромицин Очевидно, это обусловило сложные симбиотические взаимоотношения аллохтонной и автохтонной микрофлоры кишечника, являющейся эволюционно закрепленной формой ее существования. Между тем в кишечнике рыб функционирует собственная иммунная система, представленная мощным лейкоцитарным слоем в слизистой оболочке и пейеровыми бляшками, содержащими В-, М- и Т-клетки. Кроме того, существенна роль автохтонной микрофлоры в синтезе антибиотических веществ, подавляющих рост аллохтонной патогенной микрофлоры [16, 17]. Функциональными особенностями иммунной системы волжского судака являются хорошо развитые клеточные механизмы неспецифической резистентности – активность нейтрофилов в лизосомальном – катионовом тесте и фагоцитозе, а также невысокий показатель повреждения нейтрофилов [18]. Кроме того, у рыб лизоцим и комплимент занимают важное место среди агентов, обладающих антибактериальным действием. Они представлены системой низкомолекулярных белков, вызывающих лизис микроорганизмов путем гидролиза нерастворимых полисахаридов клеточных оболочек. Обнаружены в слизи кожи, жабр, стенках кишечника и желчных кислотах печени с максимальной активностью осенью. Предполагают, что некоторые рыбы имеют иммуноглобулины [19, 20]. В связи с этим печень принимает активное участие в иммунных реакциях не только осуществляя детоксикацию организма рыб, но и выполняя роль противомикробной защиты. Поэтому можно предположить, что этот орган, имея потенциал противомикробной защиты, обеспечивает динамичное снижение микроорганизмов, устойчивых к антибактериальным препаратам. В пользу этого свидетельствуют данные рис. 3. Они показывают, что уровень антибиотикорезистентных штаммов исследуемых микроорганизмов был в среднем в 1,1–1,3 раза выше в печени по сравнению с теми же показателями кишечной микрофлоры и ниже в 1,1–1,5 раза «водных» штаммов. Исключение отмечено только в отношении левомицетина, устойчивость к которому была у микроорганизмов, изолированных из печени, в среднем в 2,6 раза выше, чем у кишечной микрофлоры, а осенью она увеличилась в 3,1 раза. Можно предположить, что печень судака, наряду с кишечником, играет существенную роль в элиминировании энтеробактерий, при этом снижая их антибиотикорезистентность. Полученные данные по антибиоткорезистентности микрофлоры судака и воды в местах его обитания могут быть использованы в качестве индикаторов санитарно-эпидемиологического и экологического неблагополучия гидроэкосистемы. Заключение Таким образом, анализ многолетнего материала свидетельствует о значительном персистировании в воде и рыбе антибиотикорезистентной микрофлоры сем. Enterobacteriaceae. Полирезистентными оказались 51,5 ± 0,4 % штаммов, выделенных из воды, и 47,7 ± 0,7 %, изолированных из рыбы. Минимальная устойчивость всех испытуемых микроорганизмов отмечена к тобромицину и левомицетину, а максимальная – к бензилпенициллину и ампициллину. Показатели устойчивости к антибактериальным препаратам у водных штаммов были в 1,2–1,4 раза выше, чем у рыбных во все сезоны наблюдений с динамичным снижением от весны к осени в 2,7 раза у водных и в 1,9 раза – у рыбных штаммов. При этом отмечена тенденция роста зоны угнетения на МПА со всеми испытуемыми препаратами и штаммами бактерий от весны к осени. Иммунная система, по литературным данным [19, 20], функционирующая в кишечнике и печени рыб, по-видимому, обусловила снижение доли антибиотикорезистентных штаммов в этих органах. Они были значительно ниже аналогичных показателей у «водных» штаммов. Максимальная антибиотикорезистентность всех тестируемых рыбных штаммов была зарегистрирована весной, во время паводка, а минимальная – осенью, во время интенсивного питания этого вида рыб, что обусловлено сложными симбиотическими взаимоотношениями аллохтонной антибиоткорезистентной и автохтонной микрофлорой рыбы, способной также продуцировать свои антибиотики. Следовательно, этот персистентный признак может быть различным в разных экологических нишах, т. к. в значительной степени он зависит не только от абиотических, но и биотических факторов, экологических особенностей симбионтов жертвы и пищевых цепей.