Введение Раундап, созданный на основе изопропиламиновой соли глифосата [N-(phosphonomethyl) glycine], является одним из самых известных в мире гербицидов. Его широкое применение обусловлено высокой эффективностью действия, скоростью биоразложения в окружающей среде, а также появлением культур, генетически устойчивых к этому гербициду [1]. США, Бразилия, Аргентина, Индия и Китай являются ведущими странами-производителями генетически устойчивых к Раундапу сортов сои и риса [2]. В России, а также странах бывшего СНГ Раундап широко используется для уничтожения сорной растительности на полях и приусадебных участках, а также в коллекторно-дренажных каналах, оросительных системах и прудах. Период полураспада глифосата в воде составляет 7-14 дней, в донных отложениях водоемов - до 120 дней [1], в почве - от 6 до 9 дней в лабильной фазе до 222-835 дней в нелабильной [3]. Благодаря высокой способности абсорбироваться на взвешенных частицах, он может разноситься на большие расстояния от места попадания в водоем [1]. Разложение глифосата происходит при действии микроорганизмов [4], но связывание с хелатирующими металлами (медь, цинк, свинец) в донных отложениях значительно замедляет этот процесс [5]. Механизм действия Раундапа заключается в ингибировании ферментного пути с участием шикимовой кислоты, что препятствует синтезу 3-х аминокислот: фенилаланина, тирозина и триптофана [6, 7]. У животных этот метаболический путь отсутствует. Однако, попадая в организм рыб, гербицид включается в метаболизм и может вызывать нарушения различных функций [6-11]. Кроме того, установлено, что содержащееся в составе Раундапа поверхностно-активное вещество - полиоксиэтиленамин, гораздо более токсично, чем сам глифосат [12, 13]. Основной токсический эффект Раундапа и глифосата связывают с генерацией окислительного стресса и нейротоксическим действием, приводящим к снижению активности ацетилхолинэстеразы [7, 9-11]. Изменения активности пищеварительных гликозидаз в присутствии Раундапа у беспозвоночных и молоди рыб были выявлены как в экспериментах in vivo [14, 15], так и in vitro [16]. Повышение температуры в результате глобальных климатических изменений, а также природных и антропогенных феноменов может изменять не только физиолого-биохимические показатели рыб, но и реакцию организма на химические агенты [15, 17, 18]. Медленное повышение температуры окружающей среды увеличивает активность пищеварительных гликозидаз рыб, в то время как резкие изменения температуры, не позволяющие организму адаптироваться, снижают активность ферментов и термоустойчивость рыб [19]. В то же время термоустойчивость рыб в значительной мере зависит от температуры предварительной акклимации [20]. Ранее было показано, что резкое повышение температуры воды усиливает негативный эффект хронического действия Раундапа на амилолитическую активность в кишечнике ротана [15], однако зависимость эффектов Раундапа от повышения температуры воды у рыб, акклимированных к разным значениям температуры, ранее не исследовалась. Целью нашей работы было изучить влияние резкого повышения температуры воды на чувствительность гликозидаз к in vitro действию Раундапа у молоди карпа, карася и ротана, акклимированных к температуре 13 и 32 °С. Материалы и методы исследования Работа была выполнена в осенний период 2012 г. на молоди обыкновенного карпа Cyprinus carpio (L.) (масса 1,65 ± 0,48 г; длина тела 3,98 ± 0,43 см) и серебряного карася Carassius carassius (L.) (8,52 ± 2,73 г; 6,96 ± 0,49 см), выращенных на стационаре полевых и экспериментальных работ «Сунога» Института биологии внутренних вод (ИБВВ) им. И. Д. Папанина РАН, и головешки-ротана Perccottus glenii Dybowsky (масса 4,76 ± 0,90 г; длина 4,92 ± 1,16 см), отловленного в прудах Ярославской области. По температурным характеристикам (окончательно избираемой и верхней летальной температуре) исследованные виды относятся к наиболее теплолюбивым видам рыб, обитающих в пресных водоемах северо-запада России [21]. В лабораторных условиях рыб акклимировали в течение 10 дней к температуре 13 и 32 ºC при естественном фотопериоде. Температура 13 ºC характерна для водоемов средней полосы России в осенне-весенний сезон, температура 32 ºC отмечена в аномально теплый летний период 2010 г. [22]. Рыб кормили 1 раз в сутки личинками хирономид в количестве 5-10 % от общей массы тела. Затем группу рыб (по 6 экз. в каждой, 2 повторности) помещали в экспериментальный аквариум объемом 60 л, оборудованный системой нагрева и аэрации. Температуру воды в аквариуме повышали со скоростью 8 ºС/ч до нарушения локомоторной функции рыб - переворота на бок или кверху брюшком, сублетальное значение температуры фиксировали как критический термический максимум (КТМ) [23]. Продолжительность нагрева варьировала от 1 до 2 часов в зависимости от вида рыб и температуры предварительной акклимации. Затем рыб извлекали из аквариума, помещали на стекло ледяной бани, извлекали кишечники и готовили суммарные гомогенаты из медиальной части кишечника от 6 экз. рыб одного вида. Амилолитическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал (a-амилаза КФ 3.2.1.1, глюкоамилаза КФ 3.2.1.3 и мальтаза КФ 3.2.1.20), оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [24]. Активность мальтазы определяли с помощью набора для клинической биохимии «Фотоглюкоза» (ООО «Импакт», Россия). Ферментативную активность выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 минуту инкубации ферментативно активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани, мкмоль/(г × мин). Для приготовления раствора токсиканта использовали коммерческий препарат гербицида, имеющий торговое название «Раундап» (произведен и расфасован ЗАО фирма «Август» (Россия) по лицензии фирмы «Монсанто Европа С. А.» (Бельгия)). Средство представляет собой водный раствор глифосата в концентрации 360 г/л. Дополнительные ингредиенты, усиливающие действие активного элемента или облегчающие использование гербицида, ни в аннотации, ни в тексте на упаковке не указаны. Концентрации Раундапа, рассчитанные по содержанию глифосата, составляли 0 (контроль); 0,1; 1; 10; 25 и 50 мкг/л. Выбор тестируемых концентраций был обусловлен значениями ПДК Раундапа для воды рыбохозяйственных водоемов (1 мкг/л) и содержанием глифосата в воде в районах непосредственного применения гербицида [25]. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M ± m). Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Значения КТМ у рыб, акклимированных к температуре 13 ºС, составили 31,1 ± 0,2 ºС у карпа, 32,2 ± 0,1 ºС у карася и 30,6 ± 0,2 ºС у ротана; у акклимированных к температуре 32 °С - 41,3 ± 0,1; 41,2 ± 0,1 и 38,8 ± 0,1 ºС соответственно (рис. 1). Эти результаты согласуются с данными о росте значений КТМ с повышением температуры акклимации рыб [10]. В отсутствие Раундапа уровень амилолитической активности составляет 98,6 ± 4,6 у карася и 5,62 ± 0,12 мкмоль/(г·мин) у ротана, акклимированных к температуре 13 ºC, и 121,6 ± 2,0 мкмоль/(г·мин) у карпа, акклимированного к температуре 32 ºC. Амилолитическая активность у карпа в присутствии Раундапа повышается на 8-10 %, у карася - на 20-29 % практически во всем диапазоне исследованных концентраций. У ротана в ряде случаев отмечен тормозящий эффект Раундапа на 10-19 % от контроля. Рис. 1. Амилолитическая активность в кишечнике карпа , карася и ротана , в присутствии Раундапа in vitro, мкмоль/(г·мин). Карп акклимирован к температуре 32 ºC, карась и ротан - к температуре 13 ºC. * Статистически достоверные различия показателей по сравнению с контролем (0 мкг/л), принятым за 100 % У рыб, акклимированных к температуре 13 ºC и подвергнутых затем нагреву со скоростью 8 ºС/ч, Раундап вызывает разнонаправленные эффекты: у карпа снижает амилолитическую активность на 8-18 %, у карася в ряде случаев повышает на 8-12 %, у ротана достоверные эффекты отсутствуют (рис. 2). У рыб, акклимированных к температуре 32 ºC, Раундап также вызывает разнонаправленные эффекты: у карпа снижает амилолитическую активность на 14-16 % при низких значениях концентрации и на 7 % при более высоких, у карася повышает её на 6-17 % при средних значениях концентрации, у ротана достоверное торможение на 10-12 % отмечено лишь при концентрации 0,1 и 25,0 мкг/л. Рис. 2. Амилолитическая активность, мкмоль/(г·мин), в кишечнике: а - карпа; б - карася; в - ротана в присутствии Раундапа in vitro после резкого повышения температуры воды со скоростью 8 ºC/ч, предварительно акклимированных к температуре 13 ºC - и 32 ºC - . * Статистически достоверные различия показателей по сравнению с контролем (0 мкг/л) Активность мальтазы у карпа и карася, не подвергавшихся нагреву, в присутствии Раундапа достоверно не меняется (рис. 3). У рыб, акклимированных к температуре 13 ºC, достоверное повышение ферментативной активности на 8-13 % отмечено лишь у карпа в диапазоне значений концентрации 0,1-25,0 мкг/л. У рыб, акклимированных к температуре 32 ºC, достоверные изменения отсутствуют. Рис. 3. Активность мальтазы, мкмоль/(г·мин), в кишечнике: а - карпа; б - карася в присутствии Раундапа in vitro. Активность ферментов у рыб, не подвергавшихся нагреву (карп акклимирован к температуре 32 ºC, карась - к температуре 13 ºC), и после резкого повышения температура воды со скоростью 8 ºC/ч, предварительно акклимированных к температуре 13 ºC и 32 ºC . * Статистически достоверные различия показателей по сравнению с контролем (0 мкг/л), принятым за 100 % Необходимо отметить, что в данной работе зависимости величины эффекта от концентрации Раундапа не выявлено ни в одном из случаев экспериментальных воздействий. Ранее были показаны изменения активности гликозидаз в целом организме и слизистой оболочке кишечника у молоди рыб в присутствии Раундапа in vitro [16]. Гербицид вызывает разнонаправленные изменения активности мальтазы, сахаразы, амилолитической активности у плотвы Rutilus rutilus (L.), судака Sander lucioperca (L.), тюльки Сlupeonella cultriventris (Nord.), щуки Esox lucius L., карпа и окуня Perca fluviatilis L. [26]. При этом установлено, что гликозидазы слизистой оболочки кишечника более чувствительны к действию Раундапа по сравнению с одноименными ферментами химуса и целого организма. Раундап оказывает больший ингибирующий эффект на активность гликозидаз в тканях реальной жертвы (плотва, извлеченная из желудка щуки) по сравнению с потенциальной жертвой. Величина и направленность эффектов зависят от вида рыб, спектра ферментов, участвующих в гидролизе углеводов, а в ряде случаев - и от концентрации гербицида [16, 26]. Кроме того, в экспериментах in vitro было установлено, что эффекты Раундапа зависят от температуры и pН [27]. В ходе исследований были выявлены также видовые различия при действии Раундапа in vitro в отсутствие и в условиях резкого повышения температуры воды. Наименьшие изменения амилолитической активности в присутствии гербицида выявлены у ротана, что хорошо согласуется с данными о его высокой устойчивости к действию неблагоприятных факторов [28, 29]. При этом ферменты, гидролизующие крахмал, более чувствительны к действию Раундапа во всех вариантах воздействия, по сравнению с мальтазой. Последнее хорошо согласуется с данными о большей чувствительности к действию антропогенных факторов панкреатических ферментов по сравнению с собственно мембранными [30]. Заключение Полученные результаты свидетельствуют о разнонаправленном действии Раундапа на гликозидазы кишечника теплолюбивых видов рыб - стимулирующий у карпа и карася и тормозящий у ротана. Повышение температуры воды со скоростью 8 °С/ч изменяет величину эффекта у исследованных видов рыб в зависимости от температуры предварительной акклимации. Резкое повышение температуры воды вызывает торможение амилолитической активности у карпа, акклимированного к температуре 13 °С, преимущественно при высоких концентрациях, акклимированного к температуре 32 °С, - при низких концентрациях Раундапа. У карася, акклимированного к обоим значениям температуры, резкий рост температуры воды снижает величину стимулирующего эффекта. У ротана, акклимированного к температуре 13 °С, при повышении температуры достоверные эффекты отсутствуют, у акклимированного к 32 °С - практически не изменяются по сравнению с таковыми без нагрева. Активность мальтазы в присутствии Раундапа достоверно повышалась лишь у карпа, акклимированного к температуре 13 ºC и подверженного нагреву. Существенных изменений активности мальтазы в кишечнике карася не отмечено. Таким образом, резкое изменение температуры среды может изменять чувствительность гликозидаз кишечника теплолюбивых видов рыб к действию Раундапа.