Введение Загрязнение водной среды пестицидами является одной из наиболее важных экологических проблем. Возросшие масштабы использования пестицидов приводят к трансформации водных экосистем, негативно влияют на состояние водных животных и представляет угрозу здоровью человека. Раундап - неспецифический гербицид широкого спектра действия. В его состав входит активный ингредиент глифосат и полиоксиэтиленамин - поверхностно-активное вещество, облегчающее проникновение гербицида. Раундап используется для уничтожения сорной растительности не только на полях и приусадебных участках, но и в водоемах (коллекторно-дренажных каналах, оросительных системах, прудах). Концентрации глифосата при использовании в сельском хозяйстве составляют от 0,36 до 2,16 мг/л [1]. В поверхностных водах концентрация глифосата обычно не превышает 10-15 мкг/л, однако вблизи районов непосредственного применения она варьирует от 10 до 700 мкг/л в воде и от 0,35 до 5,0 мг/кг в седиментах [2]. Значение предельно допустимой концентрации (ПДК) глифосата в рыбохозяйственных водоемах России составляет 1 мкг/л [3]. По данным Всемирной организации здравоохранения, токсичность глифосата рассматривается как низкая [4], однако присутствие сурфактантов делает глифосатсодержащие гербициды потенциально токсичными для водных организмов. Кроме того, неумеренное использование, аварийные разливы, смывы с полей или сброс неочищенных сточных вод в природные водоемы могут увеличивать их содержание и оказывать вредное воздействие на гидробионтов, вызывая долгосрочные эффекты. В последние годы накоплено много сведений о токсичности Раундапа [5-8], а Европейский союз признал глифосат опасным для окружающей среды и токсичным для водных организмов. Значения 96 ч ЛК50 Раундапа варьируют от 2 до 55 мг/л в зависимости от вида рыб, стадии жизненного цикла и условий эксперимента [9]. Показано, что экспозиция к Раундапу (96 ч) в концентрации 3-20 мг/л подавляет активность ацетилхолиностеразы мозга лепорины Leporinus obtusidens Val., снижая скорость разложения ацетилхолина и проводимость нервных импульсов, в результате чего нарушаются поведение рыб и их ориентация в пространстве [1]. Кроме того, при таких концентрациях Раундапа отмечено увеличение содержания глюкозы и гликогена в печени и уменьшение этих показателей в мышцах лепорины. В экспериментах in vitro установлено, что Раундап в концентрациях 0,1-50 мкг/л может изменять активность гликозидаз в кишечнике молоди рыб и организме объектов их питания [5, 10]. При попадании глифосата в водоемы его концентрация значительно снижается как вследствие прямого разбавления, так и за счет разложения микроорганизмами [11] и связывания хелатирующими металлами (Ca, Fe, Al, Cu, Zn, Pb, Mn), органическим углеродом и гуминовыми кислотами в донных отложениях [12, 13]. Однако действие сверхмалых концентраций гербицида на активность пищеварительных ферментов рыб практически не изучено. Поскольку углеводы играют важную роль в энергетическом и пластическом обмене организма, а гидролазы жертвы могут обеспечивать аутодеградацию собственных тканей, изучение характеристик указанных ферментов при действии Раундапа представляет значительный интерес для практики рыбного хозяйства. Целью нашей работы было изучить in vitro влияние гербицида Раундап в широком диапазоне концентраций (от сверхнизких до высоких) на уровень активности гликозидаз у молоди рыб. Материалы и методы исследования Работа выполнена в летний период 2015 г. на молоди плотвы Rutilus rutilus (L.) (масса 5,3 ± 0,1 г, длина тела 6,6 ± 0,1 см) и обыкновенного карася Carassius carassius (L.) (2,1 ± 0,5 г, 3,9 ± 0,3 см), отловленных в прибрежной зоне Рыбинского водохранилища (Ярославская область). Рыб в течение двух часов после поимки доставляли в лабораторию, затем обездвиживали и помещали на стекло ледяной бани. У плотвы вскрывали брюшную полость, извлекали кишечники и освобождали их от химуса. Активность гликозидаз (мальтаза, амилолитическая активность) определяли в суммарных гомогенатах (включающих медиальный отдел кишечника от 20 экз. плотвы или целые тушки от 5 экз. карася), приготовленных на растворе Рингера для холоднокровных животных (110 мМ NaCl, 1,9 мМ KCl, 1,3 мМ CaCl2), рН 7,4. Растворы субстратов (картофельный крахмал в концентрации 18 г/л и 50 ммоль раствор мальтозы) готовили на таком же растворе Рингера. Предварительно гомогенаты инкубировали с равным количеством Раундапа определенной концентрации в течение 1 часа. Затем добавляли раствор субстрата и продолжали инкубацию в течение 30 минут при температуре 20 °С, рН 7,4 и непрерывном перемешивании. Амилолитическую активность, отражающую суммарную активность гликозидаз, гидролизующих крахмал (a-амилазы КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы КФ 3.2.1.3 и мальтазы КФ 3.2.1.20), оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [14]. Для определения активности мальтазы применяли набор для клинической биохимии «Фотоглюкоза» (ООО «Импакт», Россия). Ферментативную активность выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 минуту инкубации ферментативно-активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/(г × мин)). Для приготовления раствора токсиканта использовали коммерческий препарат гербицида, имеющий торговое название «Раундап» (произведен и расфасован ЗАО «Фирма «Август» (Россия) по лицензии фирмы «Монсанто Европа С. А.» (Бельгия)). Средство представляет собой 36 %-ный водный раствор глифосата. Возможные инертные ингредиенты, усиливающие действие активного элемента или облегчающие использование гербицида, в аннотации не указаны. Концентрации Раундапа, рассчитанные по содержанию глифосата, находились в широком диапазоне - от сверхнизких (1·10-13-1·10-8 мкг/л) до высоких (1 г/л) значений, в контроле вместо Раундапа использовался раствор Рингера. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M ± m). Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p ≤ 0,05. Результаты исследования и их обсуждение В целом организме молоди карася амилолитическая активность составила 14,5 ± 0,31 мкмоль/(г× мин). Наиболее низкие концентрации Раундапа (1·10-13-1·10-8 мкг/л) повышают её, более высокие - снижают (рис. 1). Наибольшее снижение (на 47 % от контроля) отмечено при максимальной концентрации Раундапа - 1 г/л. При этом прослеживается волнообразная смена эффектов в пределах нескольких порядков концентраций, а концентрации, различающиеся на 3-6 порядков, могут вызывать одинаковый эффект. Так, снижение амилолитической активности на 8-11 % отмечено при концентрациях Раундапа 1·10-6, 1·10-3, 1·10-2, 10 и 50 мкг/л, а также на 14-16 % от контроля при концентрациях 25 мкг/л, 25 и 100 мг/л. Рис. 1. Амилолитическая активность в целом организме молоди карася при разных концентрациях Раундапа in vitro, % от контроля. Здесь и на рис. 2, 3: - различия показателей статистически достоверны по сравнению с контролем, p ≤ 0,05; - различия показателей недостоверны по сравнению с контролем, p > 0,05 Амилолитическая активность в кишечнике молоди плотвы (0 мг/л Раундапа) составила 18,22 ± 0,98 мкмоль/(г·мин). Снижение ферментативной активности в присутствии Раундапа отмечено во всем диапазоне исследованных концентраций, исключая ряд значений ниже 0,01 мкг/л (рис. 2). В диапазоне концентраций Раундапа 0,01-50 мкг/л амилолитическая активность была ниже контроля на 17-22 %, в диапазоне от 1 мг/л до 1 г/л - на 30-80 %. При этом концентрации, различающиеся на 2-17 порядков, вызывали равные по величине эффекты. Так, снижение амилолитической активности на 29-30 % выявлено при концентрациях гербицида 1·10-13, 1·10-11 мкг/л и 1 мг/л, на 16-17 % от контроля - при концентрациях 1·10-8, 1·10-5, 1·10-3, 10 и 50 мкг/л. Рис. 2. Амилолитическая активность в кишечнике молоди плотвы при разных концентрациях Раундапа in vitro, % от контроля Активность мальтазы в кишечнике молоди плотвы (0 мг/л Раундапа) составила 7,01 ± 0,26 мкмоль/(г·мин). В присутствии Раундапа статистически достоверные эффекты отмечены лишь при концентрациях выше 0,01 мкг/л (рис. 3). При этом концентрации гербицида, различающиеся на 2-4 порядка, вызывают равный эффект. Так, повышение активности мальтазы на 58-66 % выявлено в диапазоне концентраций Раундапа 0,01-1 мкг/л, на 73-76 % - в диапазоне 10-100 мг/л (исключая 1 мг/л), на 80 и 92 % от контроля - при концентрациях 1 мг/л и 1 г/л. Рис. 3. Активность мальтазы в кишечнике молоди плотвы при разных концентрациях Раундапа in vitro Активность ферментов в тканях целого организма отражает активность не только ферментов пищеварительного тракта, но и многочисленных лизосомальных гидролаз всех органов и тканей. Ранее в экспериментах in vitro было установлено, что Раундап в сублетальных концентрациях 0,1-50 мкг/л изменяет активность гликозидаз в целом организме молоди ряда видов рыб [5]. Активность мальтазы и сахаразы в присутствии Раундапа в большинстве случаев повышается, амилолитическая активность изменяется разнонаправленно в зависимости от вида рыб и концентрации гербицида. При этом большее негативное влияние Раундап оказывает на активность гликозидаз в тканях реальной жертвы (плотва, извлеченная из желудка щуки) по сравнению с потенциальной жертвой (плотва из водоема), что может быть связано с активизацией лизосомальных гидролаз в условиях кислого желудочного пищеварения [5]. Кроме того, был отмечен ингибирующий эффект Раундапа (25 мг/л) на амилолитическую активность в слизистой оболочке кишечника молоди рыб, при этом действие гербицида может усиливаться при кислых рН и низкой температуре [10]. Наибольшее снижение амилолитической активности выявлено при комплексном действии температуры 0 oС, pH 5,0 и Раундапа (25 мкг/л): у окуня Perca fluviatilis L. на 72 %, у карпа Cyprinus carpio (L.) - на 95 %, у тюльки Сlupeonella cultriventris (Nord.) - на 98 % от контроля. Если у окуня эффект обусловлен в основном совместным действием температуры и pH, то у тюльки и карпа статистически достоверное усиление эффекта отмечено при действии всех трех факторов (p < 0,0001). Согласно Е. Б. Бурлаковой с соавт. (1990), под сверхмалыми дозами понимаются концентрации биологически активных веществ ниже 10-12 М [15]. По мнению К. Г. Гуревича (2001), под сверхмалыми правильней понимать дозы, обеспечивающие концентрацию биологически активного вещества в месте действия на несколько порядков ниже константы его диссоциации с эффектором (обычно она составляет для рецепторов 10-9-10-12 М, для ферментов - 10-5-10-7 М [16]. В нашей работе использовались концентрации Раундапа от 10-20 до 10-2 М, поэтому концентрации ниже 1·10-12 М (1·10-5 мкг/л) можно рассматривать как сверхмалые. Активность мальтазы в кишечнике молоди плотвы при сверхмалых концентрациях Раундапа не меняется и растет при более высоких. Амилолитическая активность, отражающая суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал (панктреатической α-амилазы, мембранных глюкоамилазы и мальтазы) снижается практически во всем диапазоне исследованных концентраций. Это может быть обусловлено большей чувствительностью панкреатической a-амилазы к действию Раундапа по сравнению с собственно мембранным ферментом мальтазой. Интересно отметить, что концентрации, отличающиеся на 2-17 порядков, могут вызывать равный эффект. Эти результаты согласуются с данными по влиянию малых и сверхмалых концентраций хлорофоса и нитрозогуанидина на активность гликозидаз в кишечнике молоди плотвы [17, 18], а также с положением о «фазности» зависимости показателей жизнедеятельности организма от концентрации токсических веществ [19]. Полученные результаты подтверждают представления о действии сверхмалых доз биологически активных веществ и вызывают обеспокоенность по поводу применения гербицида Раундап в водных экосистемах. Заключение Раундап в диапазоне концентраций от 1·10-13 мкг/л до 1 г/л in vitro оказывает разнонаправленное действие на активность ферментов, гидролизующих ди- и полисахариды, в кишечнике и целом организме молоди рыб. Амилолитическая активность в целом организме карася выше контроля при сверхнизких концентрациях Раундапа (1·10-13-1·10-8 мкг/л) и, как правило, ниже контроля при более высоких. В кишечнике молоди амилолитическая активность удалить слово плотвы ниже контроля практически во всем диапазоне исследованных концентраций (от 1·10-13 мкг/л до 1 г/л). Активность мальтазы в кишечнике молоди плотвы выше контроля лишь при концентрациях гербицида от 0,01 мкг/л до 1 г/л in vitro, при более низких концентрациях достоверный эффект отсутствует. При этом концентрации, отличающиеся на 2-17 порядков, могут вызывать одинаковый эффект.